ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Dupleks zavarena cijev za hemijsku komponentu hemijske industrije, nedostatak SPECC1L dovodi do povećane stabilnosti spojenih spojeva i smanjenog odlaganja ćelija kranijalnog neuralnog grebena.

Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju pretraživača sa ograničenom podrškom za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Dupleks zavarene cijevi za kemijsku industriju

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.je vodeći proizvođač koji je specijaliziran za bešavne cijevi od nehrđajućeg čelika, svijetle žarene cijevi, bešavne namotane cijevi itd.Kako bismo olakšali kupcima, zavarili smo i cijevi i cijevi.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ima najnapredniju opremu za proizvodnju i testiranje.Možemo u potpunosti zadovoljiti vaše zahtjeve.Prema vrlo striktno standardu, cijevi koje proizvodimo uvijek imaju ispravnu OD i WT toleranciju.Kontrola tolerancije je strogo u skladu sa standardima proizvodnje.Naši proizvodi su uvek zadovoljni kupci.Kupci koji su kupovali naše proizvode stvarali su veći profit.
a) OD (spoljni prečnik): 3,18 mm do 101,6 mm
b) WT (debljina zida): 0,5 mm do 20 mm
c) Dužina: prema zahtjevu kupca
d) Standardi: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 itd
e) Metoda procesa: ERW, EFW itd

Klizači koji prikazuju tri članka po slajdu.Koristite dugmad za nazad i sledeće da se krećete kroz slajdove ili dugmad kontrolora slajdova na kraju za kretanje kroz svaki slajd.
Ćelije kranijalnog neuralnog grebena (CNCC) odvajaju se od embrionalnih neuralnih nabora i migriraju u faringealne lukove, koji čine većinu struktura srednjeg dijela lica.Disfunkcija CNCC igra važnu ulogu u etiologiji orofacijalnog rascjepa, uobičajene kongenitalne malformacije.Heterozigotne SPECC1L mutacije pronađene su kod pacijenata s atipičnim i sindromskim rascjepima.Ovdje izvještavamo o poboljšanom bojenju komponenti kanonskog adhezivnog spoja (AJ), β-katenina i E-kadherina u kultiviranim ćelijama za uništavanje SPECC1L, a elektronske mikrografije pokazuju apikalno-bazalnu difuziju AJ.Da bismo razumjeli ulogu SPECC1L u kraniofacijalnoj morfogenezi, kreirali smo model miša s nedostatkom Specc1l.Homozigotni mutanti su embrionalno smrtonosni i pokazuju oštećeno zatvaranje neuralne cijevi i CNCC laminaciju.Bojenje AJ proteina je povećano u mutantnim neuralnim naborima.Ovaj AJ defekt je u skladu s defektom u CNCC delaminaciji, što zahtijeva rastvaranje AJ.Osim toga, Specc11 mutanti imaju smanjenu PI3K-AKT signalizaciju i povećanu apoptozu.In vitro, blaga inhibicija PI3K-AKT signalizacije u ćelijama divljeg tipa bila je dovoljna da izazove AJ promjene.Važno je da se AJ promjene izazvane srušenjem SPECC1L mogu poništiti aktivacijom PI3K-AKT puta.Uzeti zajedno, ovi podaci sugeriraju da je SPECC1L, kao novi regulator PI3K-AKT signalizacije i AJ biologije, neophodan za zatvaranje neuralne cijevi i CNCC stratifikaciju.
Ćelije kranijalnog neuralnog grebena (CNCC) lokaliziraju se na dorzalnom neuroektodermu i odvajaju se od neuroepitela neuralnih nabora u razvoju kroz proces koji uključuje epitelno-mezenhimsku tranziciju (EMT)1,2,3.Premigrirajući epitelni CNCC ometaju međućelijske spojeve i postaju migrirajući mezenhimski CNCC koji ispunjavaju prvi i drugi faringealni luk i formiraju većinu kraniofacijalne hrskavice.Stoga su geni koji reguliraju funkciju CNCC-a često poremećeni u etiologiji kraniofacijalnih kongenitalnih anomalija kao što su orofacijalni rascjepi, koji najčešće pogađaju 1/800 rođenih samo u SAD-u.Jedan od urođenih deformiteta8.
Delaminacija CNCC-a poklapa se sa zatvaranjem prednje neuralne cijevi između 8,5 i 9,5 dana embrionalnog razvoja kod miševa.Mutanti brojnih gena povezanih s orofacijalnim rascjepom miša također pokazuju neki oblik defekta neuralne cijevi, uključujući Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 i Pdgfrα12.Međutim, procesi zatvaranja neuralne cijevi i CNCC stratifikacije mogu se smatrati neovisnim, jer Splotch mutantni miš (Pax3) pokazuje defekte u zatvaranju neuralne cijevi bez ikakvog utjecaja na CNCC stratifikaciju ili migraciju 13,14.Dodatni modeli miša s defektima u CNCC disekciji i zatvaranju neuralne cijevi pomoći će da se ocrta zajednička molekularna osnova ova dva procesa.
Izolacija CNCC iz neuroepitelnih ćelija zahtijeva rastvaranje adhezivnih spojeva (AJs), koji se sastoje od proteinskih kompleksa koji sadrže, između ostalog, E-kadherin, β-katenin, α-E-katenin i α-aktinin povezan s aktinskim filamentima 2 Studije prekomerne ekspresije E-kadherina u neuralnim naborima su pokazale smanjenje ili kašnjenje u CNCC delaminaciji.Suprotno tome, supresija E-kadherina rezultira ranom stratifikacijom15,16.Mnogi faktori koji posreduju EMT tokom CNCC stratifikacije su faktori transkripcije (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) i proteini remodeliranja ekstracelularnog matriksa (ECM), kao što su matriks metaloproteinaze (MMP), međutim CNCC su direktni regulatori citoskela. još nije poznato.Poznato je da put PI3K-AKT antagonizira nivoe E-kadherina, uglavnom iz istraživanja raka17.Nedavne studije su pokazale da gubitak PI3K-AKT signalizacije zasnovane na PDGFα kod miševa dovodi do kraniofacijalnih abnormalnosti, uključujući rascjep nepca i defekte neuralne cijevi12.Međutim, odnos između PI3K-AKT puta i stabilnosti AJ nakon CNCC stratifikacije je nejasan.
Prethodno smo identificirali SPECC1L kao prvi mutantni gen kod dvije osobe s teškim rascjepom koji se proteže od usta do oka, poznatim kao kosi rascjep (ObFC) ili Tessier IV18 rascjep.SPECC1L mutacije su identificirane u dvije višegeneracijske porodice sa autosomno dominantnim Opitz G/BBB sindromom (OMIM #145410), u kojima su oboljele osobe pokazale hiperdistancu i rascjep usne/nepca19, te u jednoj porodici sa sindromom prevelike udaljenosti Tibi (OMIM #140420) .više od polovine slučajeva Opitz G/BBB sindroma je X-vezano (OMIM #300000) i uzrokovano je mutacijama gena MID1, koji kodira protein 22 skeleta ćelija povezanog s mikrotubulama.Pretpostavljamo da SPECC1L, također protein povezan s mikrotubulama i aktinskim citoskeletom, može posredovati u signalizaciji potrebnoj za remodeliranje aktinskog citoskeleta tokom ćelijske adhezije i migracije 18 .Kroz in vitro i in vivo studije, sada opisujemo SPECC1L kao novi regulator stabilnosti AJ putem PI3K-AKT signalizacije.Na ćelijskom nivou, nedostatak SPECC1L je rezultirao smanjenjem nivoa pan-AKT proteina i povećanjem apikalno-bazalne disperzije AJ, što je eliminisano hemijskom aktivacijom AKT puta.In vivo, embrioni sa nedostatkom Specc11 pokazuju oštećeno zatvaranje neuralne cijevi i smanjenu CNCC disekciju.Dakle, SPECC1L funkcionira u visoko reguliranoj signalizaciji zasnovanoj na ćelijskoj adheziji koja je potrebna za normalnu funkciju CNCC tokom morfogeneze lica.
Da bismo okarakterisali ulogu SPECC1L na ćelijskom nivou, koristili smo prethodno opisanu stabilnu ćelijsku liniju osteosarkoma U2OS deficitarnu u SPECC1L18.Ove stabilne U2OS ćelije sa srušenim SPECC1L (kd) imale su umjereno (60-70%) smanjenje nivoa SPECC1L transkripata i proteina, zajedno sa defektima u migraciji i reorganizaciji aktinskog citoskeleta 18. Nasuprot tome, ozbiljno prolazno smanjenje u Pokazalo se da SPECC1L dovodi do mitotičkih defekata 23 .Nakon dalje karakterizacije, otkrili smo da su naše stabilne SPECC1L-kd ćelije promijenile morfologiju na vrlo visokom stupnju konfluencije (Slika 1).Pojedinačne kontrolne ćelije i kd ćelije na niskom konfluentu izgledale su slično (slika 1A,D).24 sata nakon fuzije, kontrolne ćelije su zadržale svoj kockasti oblik (sl. 1B, E), dok su se SPECC1L-kd ćelije izdužile (sl. 1C, F).Stepen ove promjene u obliku ćelije je uhvaćen in vivo živom slikom kontrolnih ćelija i kd ćelija (film 1).Da bismo odredili ulogu SPECC1L u konfluentnim ćelijama, prvo smo ispitali njegovu ekspresiju.Otkrili smo da su se nivoi proteina SPECC1L povećali nakon fuzije (slika 1G), dok se nivoi transkripta SPECC1L nisu povećali (slika 1H).Pored toga, kako se gustina ćelija povećavala, protein SPECC1L se akumulirao na međućelijskim granicama (Slika 2A-E), sa uzorkom koji se preklapa sa onim β-katenina povezanog sa membranom (Slika 2A'-E').S obzirom na povezanost SPECC1L s aktinskim citoskeletom 18,23, pretpostavili smo da SPECC1L stupa u interakciju s adhezivnim spojevima na bazi aktina (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) ćelije se izdužuju pri visokoj konfluenciji (F) u poređenju sa kontrolnim U2OS ćelijama (AC).Ovdje su prikazane tri od šest vremenskih tačaka (T1, T3, T6) koje smo odabrali za različite gustine ćelija.(G) Western blot analiza koja pokazuje da je protein SPECC1L stabiliziran na visokom stupnju konfluencije u poređenju sa niskim stepenom konfluencije u kontrolnim ćelijama.Western blot SPECC1L pokazuje očekivanu traku od 120 kDa i traku veće molekularne težine, moguće post-translacijsko modificiranu (*).Western blot analiza je izvedena pod istim uslovima za nisku i visoku konfluentnost.Slike koje pokazuju SPECC1L na niskom i visokom ušću su uzete iz istog mrlja.Ista mrlja je uklonjena i ponovo ispitana antitijelom na β-aktin.(H) Kvantitativna RT-PCR analiza nije pokazala značajne promjene u nivoima SPECC1L transkripta.Trake grešaka predstavljaju SEM iz četiri nezavisna eksperimenta.
(AE) Odabrali smo šest vremenskih tačaka (T1-T6) koje predstavljaju raspon gustine ćelija za normalizaciju analize oblika ćelije i AJ promjena u U2OS ćelijama sa srušenjem SPECC1L (kd).Prvih pet od ovih vremenskih tačaka uključivalo je pojedinačne ćelije (T1), 50-70% fuziju klastera malih ćelija (T2), fuziju bez preoblikovanja kd ćelija (T3), preoblikovanje kd ćelija (T4) i 24-satne promene.u zadnjem obliku kd (T5) ćelija.SPECC1L protein je bio pretežno dispergovan u citoplazmi na T1 (A), ali je uočeno njegovo nakupljanje na međućelijskim granicama u kasnijim vremenskim tačkama (B-E, strelice).(FJ) β-katenin pokazuje sličnu akumulaciju na međućelijskim granicama povezanih sa AJ kompleksom.(A'-E') SPECC1L i β-katenin pokazuju preklapajuće bojenje na granicama ćelija pri velikoj gustini ćelija (strelice).(F'-J') U SPECC1L-kd ćelijama, bojanje β-kateninom izgleda normalno pri niskoj gustini ćelija (F'-H'), ali se širi kako se oblik ćelije mijenja (I', J'; strelice), što ukazuje da AJ su se promijenili.Šipke = 10 µm.
Zatim smo pokušali da utvrdimo efekat nedostatka SPECC1L na AJ.Koristili smo nekoliko markera povezanih sa AJ, uključujući kanonske komponente F-aktin, miozin IIb, β-katenin i E-kadherin24,25,26,27.Aktinska stresna vlakna su se povećala u SPECC1L-kd ćelijama kao što je prethodno opisano (Slika 3A,B) 18 .Miozin IIb povezan sa aktinskim filamentima pokazao je sličan porast u SPECC1L-kd ćelijama in vitro (slika 3C,D).AJ-povezan β-katenin se vezuje za kadherin na ćelijskoj membrani, pokazujući normalan obrazac ekspresije „saća“ u kontrolnim kubocitima (slika 3E,G).Zanimljivo je da na ravnim slikama pomoću konfokalne mikroskopije, β-katenin (Slika 3E,F) i E-kadherin (Slika 3G,H) bojenje na ćelijskoj membrani konfluentnih SPECC1L-deficitarnih ćelija pokazalo je istaknute obrasce proširenog bojenja.Ovo proširenje bojenja β-kateninom povezanog sa AJ u kd ćelijama bilo je najizraženije na spoju, ali izgleda da prethodi promjenama u obliku ćelije (Slika 2F-J, F'-J').Da bismo utvrdili fizičku prirodu ovog proširenog AJ bojenja, ispitali smo granice ćelija na apikalno-baznoj površini SPECC1L-kd U2OS ćelija transmisijskom elektronskom mikroskopom (TEM) (slika 3I,J).Za razliku od kontrolnih ćelija (slika 3I), koje su imale odvojene oblasti guste elektrona koje ukazuju na AJ (strelice), kd ćelije (slika 3J) su pokazale velike, susedne regione visoke elektronske gustine koja ukazuje na AJ duž apikobazalne ravni..Osim toga, na poprečnim presjecima, uočili smo opsežne nabore ćelijske membrane u kd ćelijama (Sl. S1A, B), što objašnjava prošireni uzorak traka bojenja β-kateninom i E-kadherinom (Slika 3F, H).U prilog ulozi SPECC1L u AJs, β-katenin je ko-imunoprecipitiran sa SPECC1L u lizatima konfluentnih U2OS ćelija (slika 3K).Uz prošireno imunobojenje na AJ markere, TEM analiza je bila u skladu s našom hipotezom da nedostatak SPECC1L povećava apikalno-bazalnu gustoću i varijansu AJ.
(AH) Povećano bojenje F-aktina u kd ćelijama 48 sati nakon fuzije (T6; A, B).Izmijenjeno bojenje miozina IIb povezano s F-aktinom (C, D).Glatki uzorak bojenja membrane β-katenina i E-kadherina u kontrolnim ćelijama (E, G) je poboljšan u SPECC1L-kd (F, H) ćelijama.Šipke = 10 µm.(I–J) Elektronski mikrosnimci koji posmatraju apikalno-bazalni međućelijski spoj.Kontrolne ćelije pokazuju različite oblasti guste elektronima koje ukazuju na lepljive spojeve (I, strelice).Nasuprot tome, cijeli apikalno-bazalni spoj u SPECC1L-kd ćelijama izgledao je gustom elektronom (J, strelice), što ukazuje na povećanu gustoću i disperziju adhezivnih spojeva.(K) β-katenin je ko-imunoprecipitiran sa SPECC1L u konfluentnim U2OS ćelijskim lizatima.Slika preuzeta sa jedne tačke koja predstavlja jedan od četiri nezavisna eksperimenta.
Da bismo razumjeli ulogu SPECC1L u kraniofacijalnoj morfogenezi, kreirali smo model miša s nedostatkom Specc1l koristeći dvije nezavisne ES ćelijske linije zamke, DTM096 i RRH048 (BayGenomics, CA), koje predstavljaju intron 1, a Specc1l transkripti su snimljeni na 15. (slika 15) .4A, slika S2).Genomska lokacija umetka vektora varalice određena je sekvenciranjem cijelog genoma i potvrđena PCR-om (slika S2).Oba dizajna genske zamke su takođe omogućila fuziju u okviru Specc11-lacZ reportera nakon hvatanja.Stoga je ekspresija lacZ određena X-gal bojenjem korištena kao indikator ekspresije Specc11.Oba alela su pokazala slične obrasce ekspresije lacZ, pri čemu je zamka gena DTM096 u intronu 1 pokazala jaču ekspresiju od RRH048 u intronu 15 (nije prikazano).Međutim, Specc1l je široko izražen, s posebno snažnom ekspresijom u neuralnim naborima na E8.5 (Slika 4B), u neuralnoj cijevi i procesima lica na E9.5 i E10.5 (Slika 4C, D), te u udovima u razvoju na E10.5 i oči (slika 4D).Ranije smo izvijestili da je ekspresija SPECC1L u prvom faringealnom luku na E10.5 bila prisutna u epitelu i osnovnom mezenhimu18, u skladu s CNCC linijom.Da bismo testirali ekspresiju SPECC1L u CNCC, uradili smo E8.5 neuralne nabore (Slika 4E-J) i E9.5 sekcije lobanje (Slika 4K-).Na E8.5, SPECC1L je intenzivno obojio nervne nabore (Slika 4E, H), uključujući ćelije obojene NCC markerima (Slika 4G, J).Na E9.5, SPECC1L (slika 4K, N) jako obojen migrirajući CNCC zajedno sa AP2A (slika 4L, M) ili SOX10 (slika 4O, P).
(A) Šematski prikaz gena Specc11 miša koji pokazuje inserciju vektora mamca u ćelijske klonove ES DTM096 (intron 1) i RRH048 (intron 15).(BD) lacZ bojenje heterozigotnih Specc1lDTM096 embriona koji predstavljaju Specc1l ekspresiju od E8.5 do E10.5.NE = neuroektoderm, NF = neuralni nabor, PA1 = prvi faringealni luk.(EP) SPECC1L imunobojenje sa NCC markerima AP2A i SOX10 u E8.5 (NF; EJ) neuralnim naborima i E9.5 (KP) presecima lobanje.SPECC1L bojenje je široko primijećeno u neuralnim naborima E8.5 (E, H; vrhovi strelica), uključujući ćelije označene sa AP2A (F, G; vrhovi strelica) i SOX10 (I, J; vrhovi strelica).Na E9.5, SPECC1L snažno obojeni migrirajući CNCC (K, N; strelice) označeni AP2A (L, M; strelice) i SOX10 (O, P; strelice).
Ukrštanje heterozigotnih Specc1lDTM096/+ i Specc1lRRH048/+ miševa pokazuje da dva alela genske zamke nisu komplementarna i da su heterozigoti spoja i embrionalni homozigoti za bilo koji alel genske zamke embrionalno smrtonosni (Tabela S1).Mendelijski omjeri su ukazivali na smanjenje stope preživljavanja heterozigota pri rođenju (očekivano 1,34 naspram 2,0).Zabilježili smo nizak perinatalni mortalitet među heterozigotima, neki su imali kraniofacijalne anomalije (slika S3).Međutim, niska penetracija ovih perinatalnih kraniofacijalnih fenotipova otežava proučavanje njihovih temeljnih patofizioloških mehanizama.Stoga smo se fokusirali na embrionalni smrtonosni fenotip homozigotnih Specc11 mutanata.
Većina složenih heterozigotnih ili homozigotnih Specc1lDTM096/RRH048 mutantnih embriona nije se razvila nakon E9.5-10.5 (slike 5A-D), a neuralna cijev se nije zatvorila sprijeda (slike 5B, D), a ponekad i pozadi (nije prikazano) ..Ovaj defekt zatvaranja kranijalne neuralne cijevi bio je povezan s većinom DLX2 s oznakom CNCC koji je ostao u neuralnim naborima na E10.5, što ukazuje da nema disekcije (Slika 5A'-D').Da bismo utvrdili da li je ukupna veličina CNCC-a također smanjena, označili smo CNCC linije sa GFP u našim linijama za hvatanje gena sa Wnt1-Cre i ROSAmTmG.Mi prenosimo sortirane GFP+ NCC i GFP- (RFP+) non-NCC iz cijelih embriona.U E9.5, udio CNCC-ova označenih GFP-om se nije značajno promijenio između WT i mutantnih embriona (nije prikazano), što ukazuje na normalnu CNCC specifikaciju.Stoga smo pretpostavili da je zaostalo Wnt1-Cre i DLX2 bojenje u izloženim neuralnim naborima (Slika 5B') uzrokovano defektnim CNCC slojevima, vjerojatno zbog povećane gustoće ili disperzije AJ ćelija, kao što se vidi u SPECC1L-kd ćelijama.Koristili smo NCC markere SOX10, AP2A i DLX2 da potvrdimo prisustvo CNCC u neuralnom naboru (Slika 5E-R).Na E8.5, uočeno je bojenje neuralnih nabora za sva tri NCC markera u dijelovima WT (Slika 5E, G, I) i Specc1l mutanta (Slika 5F, H, J).Na E9.5, dok su NCC markeri obojeni migrirajući NCC u WT presecima (sl. 5M, O, Q), uočeno je rezidualno NCC bojenje u izloženim neuralnim naborima Specc1l mutantnih embriona (sl. 5N, P, R).Budući da SOX10 i DLX2 označavaju migrirajuće CNCC-ove, ovaj rezultat sugerira da CNCC-ovi s nedostatkom SPECC1L postižu specifikaciju nakon migracije, ali ne uspijevaju migrirati iz neuralnih nabora.
Nedostatak Specc11 dovodi do neispravnog zatvaranja neuralne cijevi, delaminacije ćelija kranijalnog neuralnog grebena i AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrion koji nosi migrirajuće ćelije kranijalnog neuralnog grebena (CNCC) označene sa Wnt1-Cre (A').Nasuprot tome, Specc11 mutantni embrioni pokazuju otvorene neuralne nabore (B), vrhove strelica) i CNCC koji nisu migrirali (B', vrhovi strelica).(C, D') Slike svijetlog polja (C, D') i imunobojenje (C', D') CNCC markera DLX2 E10.5 WT embriona (C, C') i Specc1l (D, D').U WT E10.5 embrionima, DLX2-pozitivni CNCC kolonizuju škržne lukove (C', strelice), dok kod mutanata vidljivo bojenje ostaje u otvorenim neuralnim naborima (D', strelice) i u prvim faringealnim lukovima (D', strelice).) s nekim mrljama (strelice) koje ukazuju na slabu delaminaciju i migraciju CNCC-a.ER) Sekcije WT i Specc1l mutantnih embriona u fazama E8.5 (E–L) i E9.5 (M–R) su označene NCC markerima SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) i DLX2 (I, J, Q, R).Na E8.5, NCC bojenje je uočeno u divljim neuralnim naborima (NF) i mutantnim sekcijama.Zajedničko bojenje SOX10 i β-katenina u E8.5 WT (K) i mutantu (L) otkrilo je povećano bojenje β-katenina na granicama ćelija u neuralnim naborima.Na E9.5, uočeno je bojenje divljeg tipa migrirajućih CNCC-a (M, O, Q), dok su kod mutanata, nestratificirani CNCC-i obojeni otvorenim neuralnim naborima (N, P, R).(S–Z) Analiza in vivo AJ obeležavanja u koronalnim presecima embriona WT i Specc11DTM096/RRH048 sa mutacijom E9.5.U gornjem desnom uglu prikazana je približna presječna ravnina.U dijelovima mutantnog tkiva uočeno je pojačano bojenje F-aktina (S, T) i miozina IIb (U, V).Slično in vitro rezultatima na slici 3, kod mutantnih embriona uočeno je pojačano bojenje membrane za β-katenin (W, X) i E-kadherin (Y, Z).(AA-BB) Elektronski mikrograf preseka embrija divljeg tipa koji gleda izvan granice apikalno-bazalne ćelije pokazuje jasnu oblast gustu elektronima koja ukazuje na adhezivne spojeve (AA, strelice).Nasuprot tome, u dijelovima Specc11 mutantnih embriona (BB, strelice), cijeli apikobazalni spoj je gust elektronima, što ukazuje na povećanu gustinu i disperziju adhezivnih spojeva.
Da bismo testirali našu hipotezu da je smanjeno slojevitost uzrokovano izmijenjenim AJ, ispitali smo AJ označavanje u izloženim neuralnim naborima Specc1l mutantnih embriona (sl. 5S-Z).Uočili smo povećanje aktinskih stresnih vlakana (slika 5S, T) i prateću povećanu lokalizaciju bojenja miozinom IIB na aktinskim vlaknima (slika 5U, V).Važno je da smo uočili povećano bojenje β-katenina (Slika 5W,X) i E-kadherina (Slika 5Y,Z) na međućelijskim granicama.Takođe smo ispitali β-katenin bojenje NCC u neuralnim naborima E8.5 embriona (slika 5K, L).Činilo se da je bojenje β-kateninom jače u Specc1l mutantnim neuralnim naborima (sl. 5L i K), što sugerira da su AJ promjene počele.Na elektronskim mikrografijama sekcija lobanje E9.5 embriona, ponovo smo uočili povećano difuzno elektronsko-gusto bojenje u Specc1l mutantnim embrionima u poređenju sa WT (sl. 5AA, BB i S1E-H).Uzeti zajedno, ovi rezultati podržavaju naše in vitro rezultate u SPECC1L-kd U2OS ćelijama i sugeriraju da aberantno AJ bojenje prethodi CNCC stratifikaciji u našim mutantnim embrionima.
S obzirom na poznatu antagonističku vezu između aktivnosti AKT i stabilnosti E-kadherina,17,28 pretpostavili smo da je uključena PI3K-AKT signalizacija.Osim toga, primijetili smo subepidermalne plikove kod nekih naših mutantnih embriona koji su izbjegli smrtnost (<5%) na E9.5-10.5 i umjesto toga se smjestili na oko E13.5 (slika S3).Subepidermalne vezikule su obeležje smanjene PI3K-AKT signalizacije zasnovane na PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) su izvijestili da prekid aktivacije PI3K zasnovane na PDGFRα u PdgfraPI3K/PI3K mutantnim embrionima rezultira subepidermalnim vezikulama, defektima neuralne cijevi i fenotipovima rascjepa nepca.Zaista, nivoi pan-AKT i aktivnog fosforiliranog Ser473-AKT smanjeni su in vivo u Specc1l mutantnim tkivima do E9.5 embrionalnog zastoja (Slika 6A-D).Smanjenje nivoa fosforiliranog Ser473-AKT može biti u potpunosti posledica smanjenja nivoa pan-AKT in vivo (Slika 6E) i in vitro (Slika 6F).Smanjenje in vitro uočeno je samo kada su U2OS ćelije bile snažno spojene s promjenama u obliku ćelije i gustoći AJ (slika 6D).Dakle, naši podaci sugeriraju da je SPECC1L novi pozitivni regulator PI3K-AKT signalizacije u kraniofacijalnoj morfogenezi.
(A-E) E8.5 (A,B) i E9.5 (C,D) sekcije lobanje ili E9.5 lizati iz Specc1l mutantnih embriona (E) pokazuju nivoe aktivnog fosforiliranog S473-AKT i pan-AKT redukcije proteina , u poređenju sa kontrolnim WT.Western blotting je izveden na lizatima divljeg tipa i mutantnim lizatima pod istim uvjetima.Slike prikazane za SPECC1L su uzete iz jedne mrlje.Ista mrlja je uklonjena i ponovo ispitana anti-pan-ACT i β-aktin antitijelima.Nivoi Pan-AKT u E8.5 neuralnim naborima (A, B) i nivoi fosforiliranog S473-AKT u E9.5 dijelovima lobanje su značajno smanjeni.(F) Nivoi Pan-AKT su na sličan način smanjeni u lizatima SPECC1L-kd U2OS ćelija sakupljenih pri visokoj konfluentnosti.Trake grešaka predstavljaju SEM iz tri nezavisne Western blot kvantifikacije.(GJ) Sekcije WT embriona na E9.5 obojene sa KI67 i cijepanom kaspazom 3, respektivno, pokazujući ćelijsku proliferaciju (G, G') i malu apoptotičku aktivnost (H, H').Specc11 mutantni embrioni pokazuju uporedivu proliferaciju ćelija (I), ali je broj ćelija koje prolaze kroz apoptozu značajno povećan (J).
Zatim smo ispitali markere proliferacije i apoptoze.Nismo uočili nikakvu razliku u proliferaciji embriona E9.5 (Slika 6E, G u poređenju sa I) sa indeksom proliferacije od 82,5% za WT mutante i 86,5% za Specc1l mutante mjereno KI67 bojenjem (p <0,56, Fisherov tačan test).Slično, nismo uočili nikakvu razliku u apoptozi izmjerenoj bojenjem za cijepanu kaspazu 3 u neuralnim naborima na E8.5 do zaustavljanja embrija (nije prikazano) (nije prikazano).Nasuprot tome, apoptoza je značajno povećana kod svih E9.5 mutantnih embriona (Slika 6F, H i J).Ovo ukupno povećanje apoptoze je u skladu sa smanjenom signalizacijom PI3K-AKT i ranom embrionalnom smrtnošću29,30,31.
Zatim, da bismo potvrdili uzročnu ulogu PI3K-AKT signalizacije u AJ promjenama u našim kd stanicama, kemijski smo izmijenili put u kontrolnim i kd ćelijama (Slika 7A-F).Koristili smo kao marker fenotip promjene oblika ćelije uočen u konfluentnim SPECC1L-kd ćelijama, koji smo kvantifikovali koristeći omjer najduže dimenzije (dužine) i odgovarajuće vertikalne dimenzije (širine).Očekuje se omjer 1 za relativno okrugle ili kockaste ćelije (slika 7G).Pored oblika ćelije, takođe smo potvrdili efekat na AJ bojenjem β-kateninom (Slika 7A'-F').Inhibicija PI3K-AKT puta upotrebom wortmanina bila je dovoljna da promijeni oblik ćelije u kontrolnim ćelijama (Slika 7A,C) i AJ (Slika 7A').PI3K-AKT aktivator SC-79 nije uticao na oblik ćelije (Slika 7A, E) ili AJ ekspanziju (Slika 7A') u kontrolnim ćelijama.U SPECC1L-kd ćelijama, daljnja supresija PI3K-AKT puta rezultirala je povećanom apoptozom (slika 7B,D) i značajnim povećanjem bojenja β-kateninom (slika 7B'), što je u skladu s našim in vivo teškim mutantima.Važno je da je aktivacija PI3K-AKT puta značajno poboljšala oblik ćelije (Slika 7B,F) i AJ fenotipove (Slika 7B”).Promjene u obliku ćelije su kvantificirane kao omjer zaobljenosti ćelija (CCR) i upoređene u pogledu značajnosti kao što je gore opisano (Slika 7G).Zaista, u kontrolnim ćelijama (slika 7G, CCR = 1,56), tretman wortmaninom bio je dovoljan da značajno promijeni oblik ćelije (slika 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) u mjeri sličnoj uočenoj u SPECC1L.-kd ćelije (slika 7G, CCR = 3,46).Tretman Wortmaninom na SPECC1L-kd ćelijama (slika 7G, CCR = 3,60, zanemariv) nije bio značajniji od netretiranih kd ćelija (slika 7G, CCR = 3,46, zanemarljiv) ili kontrolnih ćelija tretiranih wortmaninom (slika 7G)., CCR = 3,46, zanemarivo) dodatno utiče na elongaciju ćelije (7G, CCR = 3,61, zanemarljivo).Ono što je najvažnije, SC-79 AKT aktivator je obnovio izduženi fenotip SPECC1L-kd ćelija (slika 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Ovi rezultati potvrđuju da SPECC1L reguliše PI3K-AKT signalizaciju i sugeriraju da umjereno smanjenje SPECC1L utiče na ćelijsku adheziju, dok snažno smanjenje dovodi do apoptoze (slika 8).
(A–F') Kontrolne (A, C, E) i SPECC1L-kd (B, D, F) ćelije tretirane inhibitorom PI3K-AKT puta wortmaninom (C, D) ili SC-79 aktivatorom (E, F) Tretman .Netretirane kontrolne ćelije su kuboidne (A) sa normalnim β-mačjim ćelijskim bojenjem (A'), dok su kd ćelije izdužene (B) sa povećanim bojanjem β-mačke (B').Nakon supresije PI3K-AKT puta, kontrolne ćelije su se izdužile (C) sa ekspanzijom β-mačke (C'), dok su kd ćelije počele da se podvrgavaju apoptozi (D), slično našim visoko mutiranim embrionima i pokazuju izuzetno pojačanu β-mačku.bojenje (D').Nakon aktivacije PI3K-AKT puta, kontrolne ćelije su ostale kockaste (E) i imale su normalno β-mačku (E') bojenje, dok su kd ćelije pokazale značajno poboljšan oblik ćelije (F) i β-mačku (F') bojenje, što ukazuje (G) Stepen promjene oblika ćelije u (AF) kvantificiran je korištenjem omjera zaobljenosti ćelije (CCR) najduže dimenzije (dužine) i odgovarajuće vertikalne dimenzije (širine) korištenjem softvera MetaMorph.Netretirane (NT) SPECC1L-kd ćelije (CCR = 3,46) bile su značajno duže od kontrolnih ćelija (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Wort inhibicija PI3K-AKT puta u kontrolnim ćelijama bila je dovoljna da izazove slično izduživanje oblika ćelije (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Slično, AKT aktivacija pomoću SC-79 u SPECC1L-kd ćelijama vratila je elongaciju ćelije na kontrolne nivoe (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10–12).Tretman Wortmaninom ćelija SPECC1L-kd rezultirao je povećanom apoptozom, ali bez daljeg povećanja promjene oblika ćelije (CCR=3,60) u poređenju sa netretiranim kd (CCR=3,46, ns) ili kontrolnim ćelijama tretiranim wortmaninom (3,61) uočeno u .ns = nije bitno.Prikazana su +/- SEM mjerenja za 50 ćelija.Statističke razlike su izračunate pomoću Studentovog t-testa.
(A) Šematski prikaz inhibicije i aktivacije PI3K-AKT puta što rezultira AJ promjenama i spašavanjem, respektivno.(B) Predloženi model stabilizacije AKT proteina pomoću SPECC1L.
Premigracijski CNCC zahtijevaju AJ lizu da se odvoje od neuroepitelnih ćelija prednjeg neuralnog nabora1,15,32.Povećano bojenje komponenti AJ i gubitak asimetrične distribucije apikalno-bazalne AJ u ćelijama s nedostatkom SPECC1L i in vitro i in vivo, u kombinaciji s fizičkom blizinom SPECC1L β-kateninu, sugeriraju da SPECC1L funkcionira kako bi pravilno održao lokalnu stabilnost AJ za mišiće organizacije.aktinski citoskelet.Povezanost SPECC1L sa aktinskim citoskeletom i β-kateninom i povećanjem broja kondenzovanih aktinskih filamenata u odsustvu SPECC1L je u skladu sa uočenim povećanjem gustine AJ.Druga mogućnost je da povećan broj aktinskih vlakana u stanicama s nedostatkom SPECC1L dovodi do promjene međućelijske napetosti.Budući da ćelijski stres utiče na dinamiku AJ 33, promjene napona mogu rezultirati difuznijim AJ 34 .Dakle, sve promjene će utjecati na CNCC slojeve.
Wnt1 je izražen u ranim neuralnim naborima koji stvaraju ćelije neuralnog grebena.Dakle, praćenje loze Wnt1-cre označava i pre- i migrirajući NCC35.Međutim, Wnt1 također označava klonove dorzalnog moždanog tkiva također izvedene iz ranih neuralnih nabora 35,36, što čini vjerojatnim da naše bojenje E9.5 mutanata za Wnt1 markere u otvorenim neuralnim naborima nije CNCC.Naše pozitivno bojenje za NCC markere AP2A i SOX10 potvrdilo je da izloženi neuralni nabori Specc11 mutantnih embriona zaista sadrže CNCC.Osim toga, budući da su AP2A i SOX10 markeri ranog migrirajućeg NCC-a, pozitivno bojenje je pokazalo da su ove ćelije postmigracijski CNCC koje se ne mogu stratificirati pomoću E9.5.
Naši podaci sugeriraju da je molekularna regulacija AJ od strane SPECC1L posredovana PI3K-AKT signalizacijom.AKT signalizacija je smanjena u ćelijama i tkivima sa nedostatkom SPECC1L.Nalazi Fantauzzo et al.podržavaju direktnu ulogu PI3K-AKT signalizacije u kraniofacijalnoj morfogenezi.(2014) su pokazali da nedostatak aktivacije PI3K-AKT signalizacije zasnovane na PDGFRα dovodi do fenotipa rascjepa nepca.Također pokazujemo da je inhibicija PI3K-AKT puta dovoljna da promijeni AJ i oblik ćelije u U2OS ćelijama.U skladu s našim nalazima, Cain et al.37 pokazalo je da smanjenje regulacije PI3K α110 podjedinice u endotelnim ćelijama rezultira sličnim povećanjem pericelularnog bojanja β-kateninom, što se naziva povećanjem “indeksa povezivanja”.Međutim, u endotelnim ćelijama čiji su aktinski filamenti već visoko organizovani, supresija PI3K-AKT puta dovodi do labavog oblika ćelije.Nasuprot tome, SPECC1L-kd U2OS ćelije su pokazale izduženi oblik ćelije.Ova razlika može biti specifična za tip ćelije.Dok supresija PI3K-AKT signalizacije trajno utiče na aktinski citoskelet, efekat na oblik ćelije je određen promenama u napetosti izazvanim promenama u gustini i organizaciji centralnih aktinskih vlakana.U U2OS ćelijama koristili smo samo promjene oblika ćelije kao marker promjene i oporavka AJ s nedostatkom SPECC1L.U zaključku, pretpostavljamo da inhibicija AKT puta u nedostatku SPECC1L povećava stabilnost AJ i smanjuje delaminaciju u CNCC.
Zanimljivo je da su nivoi pan-AKT smanjeni in vitro i in vivo uz fosforilisane nivoe 473-AKT u odsustvu SPECC1L, što ukazuje na regulaciju PI3K-AKT signalizacije na nivou stabilnosti ili prometa AKT proteina.SPECC1L i MID1 geni, oba povezana s Opitz/GBBB sindromom, kodiraju proteine ​​koji stabiliziraju mikrotubule 18,22.Mehanizam kojim SPECC1L i MID1 posreduju stabilizaciju mikrotubula nije u potpunosti shvaćen.U slučaju SPECC1L, ova stabilizacija uključuje pojačanu acetilaciju podskupa mikrotubula 18 .Moguće je da SPECC1L koristi sličan mehanizam za stabilizaciju drugih proteina kao što je AKT.Pokazalo se da acetilacija lizinskih ostataka u AKT proteinu dovodi do smanjenja membranske lokalizacije i fosforilacije38.Osim toga, ubikvitinacija lanca K63 na istom lizinskom ostatku na AKT-u je potrebna za njegovu lokalizaciju i aktivaciju na membrani39,40.Među nekoliko faktora koji stupaju u interakciju sa SPECC1L proteinima identificiranim u različitim visokopropusnim dvohibridnim ekranima kvasca, četiri – CCDC841, ECM2942, APC i UBE2I43 – su uključeni u promet ili stabilnost proteina putem ubikvitinacije ili sumoilacije.SPECC1L može biti uključen u posttranslacijsku modifikaciju AKT lizinskih ostataka, utičući na stabilnost AKT.Međutim, kritična uloga SPECC1L u lokalizaciji i stabilnosti AKT proteina ostaje da se razjasni.
Ozbiljni defekti ekspresije SPECC1L in vivo doveli su do povećanog bojenja AJ markera i defektnog prekrivanja CNCC, kao i do povećane apoptoze i rane embrionalne letalnosti.Prethodni izvještaji su pokazali da su mutanti miša s povećanim nivoom apoptoze povezani s defektima neuralne cijevi 44,45,46,47 i kraniofacijalnim defektima48.Pretpostavlja se da prekomjerna smrt stanica u neuralnim naborima ili faringealnim lukovima može dovesti do nedovoljnog broja ćelija potrebnih za pravilno morfogenetsko kretanje 48,49,50.Nasuprot tome, naše ćelijske linije s nedostatkom SPECC1L sa umjereno smanjenom ekspresijom SPECC1L pokazale su samo AJ promjene bez dokaza povećane ćelijske smrti.Međutim, hemijska inhibicija PI3K-AKT puta u ovim Kd ćelijama je rezultirala povećanom apoptozom.Dakle, umjereno smanjenje ekspresije ili funkcije SPECC1L osigurava preživljavanje stanica.Ovo je u skladu sa zapažanjem da rijetki Specc11 mutantni embrioni koji izbjegnu hapšenje kod sv.E9.5—možda zbog smanjene efikasnosti hvatanja gena—u stanju su zatvoriti svoje neuralne cijevi i zaustaviti se kasnije u razvoju, često sa kraniofacijalnim defektima (slika S3).S tim u skladu je i rijetka pojava heterozigotnih Specc1l embriona s kraniofacijalnim abnormalnostima—vjerovatno zbog povećane efikasnosti hvatanja gena—kao i nalaz kod zebrica kod kojih jedan od dva SPECC1L ortologa (specc1lb) uzrokuje kasni embrionalni gubitak fenotipova donje vilice i bilateralni rascjepi51.Dakle, heterozigotne mutacije gubitka funkcije SPECC1L identificirane kod ljudskih pacijenata mogu uzrokovati mala oštećenja funkcije SPECC1L tokom kraniofacijalne morfogeneze, dovoljna da objasne njihove orofacijalne pukotine.Regulacija međućelijskih kontakata zasnovana na SPECC1L može također igrati ulogu u palatogenezi i fuziji faringealnih lukova.Dalja istraživanja funkcije SPECC1L pomoći će da se razjasni uloga privremenih međućelijskih kontakata u CNCC-u tokom zatvaranja neuralne cijevi u motilitetu neuroepitelijalne ćelije i kraniofacijalnoj morfogenezi.
Kontrola U2OS osteosarkoma i SPECC1L-kd ćelije su prethodno opisane (Saadi et al., 2011).Antitijela protiv SPECC1L su također ranije karakterizirana (Saadi et al., 2011).Anti-β-katenin antitijela (zeč; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (miš; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miozin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis). ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifornija), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ) , KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), cijepana kaspaza 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) i β-aktin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) je korišten kako je opisano..Aktinski filamenti su obojeni Acti-stain rhodamine faloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS kontrolne ćelije i SPECC1L-kd ćelije su uzgajane u standardnom DMEM sa visokim nivoom glukoze sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (Life Technologies, Carlsbad, CA).Za AJ promjene, 2 x 105 ćelija je zasejano na staklo tretirano sa 0,1% svinjskog želatina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i promatrano za promjene u obliku ćelija.Ćelije su sakupljene u različitim naznačenim vremenskim tačkama: 4 sata nakon sjetve (t = 1), 24 sata nakon sjetve (t = 2), spajanje bez promjene oblika ćelije (t = 3), promjena oblika ćelije (t = 4) , 24 h nakon promjene oblika ćelije (t = 5) i 48 h nakon promjene oblika ćelije (t = 6) (sl. 1, 2, 3).Da bi se modulirao PI3K-AKT put, ćelije su kultivisane u naznačenim koncentracijama sa PI3K-AKT inhibitorom wortmaninom (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ili SC-79 aktivatorom (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Podloga koja sadrži hemikalije mijenjala se svakodnevno.
Snimci okvir po kadar su napravljeni na živim kontrolnim i KD ćelijama u normalnim uslovima kulture, a slike faznog kontrasta su prikupljane svakih 10 minuta tokom 7 dana.Slike su dobijene pomoću kompjuterski kontrolisanog Leica DM IRB invertnog mikroskopa opremljenog mehaničkim stepenom i 10 × N-PLAN objektivom povezanim sa QImaging Retiga-SRV kamerom.Tokom snimanja, ćelijske kulture su održavane na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2.
Dvije ES ćelijske linije za hvatanje gena DTM096 i RRH048 iz Regionalnog centra za mutantne miševe (UC Davis, CA) korištene su za generiranje Specc11 deficitarnih linija miša, označenih Specc1lgtDTM096 i Specc1lgtRRH046.Ukratko, 129/REJ ES ćelije su ubrizgane u C57BL6 blastociste.Rezultirajući himerni muški miševi su uzgajani sa ženkama C57BL6 miševa kako bi se identificirali potomci s agouti obojenom dlakom.Za identifikaciju heterozigota korišteno je prisustvo vektorskih umetaka genske zamke.Miševi su držani na mješovitoj pozadini 129/REJ;C57BL6.Lokacija insercionog mjesta vektora genetske zamke potvrđena je RT-PCR-om, sekvenciranjem genoma i genetskom komplementacijom (dopunska slika 1).Da bi se pratila CNCC loza dvostrukih heterozigotnih Specc1lGT miševa, ukršteni su ROSAmTmG (#007576) i Wnt1-Cre (#003829) miševi (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) kako bi se proizveo ROSAmTmG i Wnt1-Cre mutant u Specc1ls.Svi eksperimenti na miševima izvedeni su prema protokolima odobrenim od strane Institucionalnog komiteta za brigu o životinjama i upotrebu Medicinskog centra Univerziteta u Kanzasu.
Embrioni su fiksirani u (1% formaldehida, 0,2% glutaraldehida, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) 60 minuta na sobnoj temperaturi.Nakon fiksacije u X-gal rastvoru za bojenje (5 mM kalijum fercijanida, 5 mM kalijum ferocijanida, 2 mM MgCl2, 0,01% natrijum deoksiholata, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Razvijanje mrlje je izvršeno na 37°C .°C u roku od 1-6 sati.Embrioni su naknadno fiksirani u 4% PFA i vizualizirani.
Za Western blotting, ćelije su lizirane u puferu za pasivnu lizu (Promega, Fitchburg, WI) sa dodatkom mješavine inhibitora HALT proteaze (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lizati su obrađeni na 12% poliakrilamidnim Mini-PROTEAN TGX gotovim gelovima (Bio-Rad, Hercules, CA) i prebačeni na Immobilon PVDF membrane (EMD Millipore, Billerica, MA).Membrane su blokirane u 5% mlijeka u PBS koji sadrži 0,1% Tween.Antitijela su inkubirana preko noći na 4°C ili jedan sat na sobnoj temperaturi.Za generiranje signala korišten je Femto SuperSignal West ECL reagens (Thermo Scientific, Waltham, MA).Za imunološko bojenje, embrioni su fiksirani preko noći u 4% PFA/PBS i kriokonzervirani.Kriosekcije tkiva su blokirane u PBS-u koji sadrži 1% normalnog kozjeg seruma (Thermo Scientific, Waltham, MA) i 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), a zatim inkubirani na 4°C u inkubatoru tokom noć.sa anti-antitelom i fluorescentnim sekundarnim antitelom (1:1000) tokom 1 sata na 4°C.Obojeni rezovi su stavljeni u ProLong zlatni medijum (Thermo Scientific, Waltham MA) i ravne slike su dobijene korišćenjem Leica TCS SPE konfokalnog mikroskopa.Svako imunobojenje izvedeno je kao tri nezavisna eksperimenta na cirosekcijama najmanje dva mutantna embriona.Prikazan je reprezentativni eksperiment.
Ćelije su inkubirane u modificiranom RIPA puferu (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glicerol, 2 mM EDTA i inhibitor HALT proteaze (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Ukratko, lizati su prethodno pročišćeni magnetnim zrncima proteina G (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornija) i zatim inkubirani preko noći na 4°C sa anti-SPECC1L ili IgG proteinskim G proteinskim kuglicama korištene su za ekstrakciju SPECC1L i Western blotting je izveden korištenjem anti -β-katenin antitijelo opisano gore. Prikazani ko-IP eksperimenti su reprezentativni za četiri nezavisna eksperimenta.
Fiksne kultivisane ćelije ili embrionalna tkiva miša dostavljeni su centru za elektronsku mikroskopiju na Univerzitetu u Kanzasu.Ukratko, uzorci su ugrađeni u EMbed 812 smolu (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polimerizirani preko noći na 60°C i izrezani na 80 nm korištenjem Leica UC7 ultramikrotoma opremljenog dijamantskom oštricom.Sekcije su vizualizovane korišćenjem JEOL JEM-1400 transmisionog elektronskog mikroskopa opremljenog 100 kV Lab6 pištoljem.
Kako citirati ovaj članak: Wilson, NR et al.Nedostatak SPECC1L dovodi do povećane stabilnosti spojenih zglobova i smanjene delaminacije ćelija kranijalnog neuralnog grebena.nauku.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Indukcija i diferencijacija neuralnog grebena.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Ćelije kranijalnog neuralnog grebena u pokretu: njihova uloga u kraniofacijalnom razvoju.Američki časopis medicinske genetike.Dio A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurokristopathia: njen rast i razvoj preko 20 godina.Pedijatar.patologija.laboratorija.lijek.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU i Noten MM Proboj u genetici orofacijalnih rascjepa.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. i Riley, FM Molekularni mehanizmi migracije ćelija neuralnog grebena i uzorka tokom kraniofacijalnog razvoja.Development 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH i Murray, JK Rascjep usne i nepca: razumijevanje genetskih i okolišnih utjecaja.prirodan komentar.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Abnormalna morfogeneza kože, udova i kraniofacijalne regije kod miševa sa nedostatkom interferonskog faktora 6 (Irf6).National Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Dominantne mutacije u GRHL3 uzrokuju van der Waordov sindrom i ometaju razvoj oralnog periderma.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ i Juriloff, DM Ažurirajte listu mišjih mutanata sa defektima u zatvaranju neuralne cijevi i napredujte prema potpunom genetskom razumijevanju zatvaranja neuralne cijevi.Istraživanje urođenih mana.Dio A, Klinička i molekularna teratologija 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K posredovana PDGFRalpha signalizacija reguliše preživljavanje i proliferaciju u razvoju skeleta putem intracelularnog puta zavisnog od p53.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND i Murdoch, JN Disheveled: Odnos konvergentne ekspanzije prema zatvaranju neuralne cijevi.Trendovi u neurologiji.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).