347 kemijska komponenta cijevi sa namotanim cijevima, Identifikacija novih proteina šaperona humanog leukocitnog antigena-A (HLA-A) koji reagiraju na interferon korištenjem umrežene masene spektrometrije (CLMS)

Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju pretraživača sa ograničenom podrškom za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Klizači koji prikazuju tri članka po slajdu.Koristite dugmad za nazad i sledeće da se krećete kroz slajdove ili dugmad kontrolora slajdova na kraju za kretanje kroz svaki slajd.

opis proizvoda

Cevi od nerđajućeg čelika 347L, klasa čelika: SS347L

Interferonski signalni sistem indukuje snažan odgovor citokina na širok spektar patogenih i intrinzičnih patoloških signala iz okoline, što rezultira indukcijom podskupova proteina inducibilnih interferonom.Primijenili smo DSS-posredovanu masenu spektrometriju (CLMS) za otkrivanje novih interakcija protein-protein u domeni proteina induciranih interferonom.Pored očekivanih proteina inducibilnih interferonom, identifikovali smo i nove intermolekularne i intramolekularne umrežene adukte kanonskih proteina inducibilnih interferonom kao što su MX1, USP18, OAS3 i STAT1.Fokusirali smo se na ortogonalnu validaciju novog skupa interferonom inducibilnih proteinskih mreža formiranih od HLA-A proteina (H2BFS-HLA-A-HMGA1) korištenjem ko-imunoprecipitacije i njihovo daljnje proučavanje korištenjem modeliranja molekularne dinamike.Modeliranje konformacijske dinamike proteinskog kompleksa otkrilo je nekoliko interakcijskih mjesta koja odražavaju interakcije identificirane u CLMS nalazima.Zajedno predstavljamo pilot studiju CLMS za identifikaciju novih signalnih kompleksa induciranih interferonom i radujemo se široj upotrebi CLMS-a za identifikaciju nove dinamike interakcija proteina u mikrookruženju tumora.
Prije nego što započne adaptivni imunološki odgovor, urođeni odbrambeni sistem domaćina pokreće antimikrobni odgovor posredovan familijom alfa-helikalnih citokina zvanih interferoni (IFN).Klase IFN-a tipa I IFNα i IFNβ aktiviraju ćelijske odgovore, uključujući antivirusna, proapoptotička, proinflamatorna i antiproliferativna stanja.Kod ljudi je poznato 13 podtipova IFNα, svi grupirani na hromozomu 91. Iznenađujuće, samo IFNα2 je proučavan za kliničku upotrebu.Nedavno je posebna pažnja posvećena istraživanju drugih podtipova IFNα.Nedavna studija je pokazala da je IFNα14 jedna od najefikasnijih izoforma u ograničavanju replikacije HBV2 i HIV-13,4 u poređenju sa kanonskim podtipom IFNα2.
Utvrđeno je da aktivirani kompleksi receptora interferona tipa I (IFNAR1 i IFNAR2) pokreću kaskadu transdukcije signala posredovanu Janus kinazama TYK2 i JAK15,6.Ove Janus kinaze fosforilišu pretvarače signala i aktivatore transkripcionih proteina (STAT1 i STAT2) na ostacima tirozina kako bi započeli heterodimerizaciju posredovanu SH2 domenom6.Nakon toga, IRF9 vezuje STAT heterodimere da bi formirao trimerni kompleks gena stimulisanog IFN faktora 3 (ISGF3), koji se translocira u jezgro i indukuje transkripciju preko 2000 interferonom stimulisanih gena (ISG)5,6,7,8.
ISG čine okosnicu urođenog imunog sistema, posebno kao odgovor na virusni napad.Kao prva linija odbrane od virusne infekcije, ćelije brzo razvijaju opsežne interakcije ćelijskih proteina sa širokim spektrom bioloških aktivnosti.Ovi proteini uključuju receptore za prepoznavanje uzoraka, signalne molekule, faktore transkripcije i proteine ​​s direktnim antivirusnim funkcijama, kao i negativne regulatore imunoloških odgovora9.Velik dio informacija o aktivnosti ISG dolazi iz funkcionalnih ekrana koji koriste ekrane prekomjerne ekspresije10,11 ili tehnike utišavanja gena (siRNA, RNAi i CRISPR)12,13 u kojima se eksprimiraju ili inhibiraju pojedinačni ISG i njihova aktivnost se testira na različitim virusima.Iako su ove studije utvrdile antivirusna svojstva pojedinačnih ISG-a, osnovni molekularni mehanizmi svakog ISG-a ostaju uglavnom nepoznati.Općenito je prihvaćeno da mnogi proteini stupaju u interakciju s jednim ili više citokina kako bi osigurali punu aktivnost, tako da ili ISG interaguju direktno ili su njihove interakcije posredovane ćelijskim proteinima.Na primjer, nedavna foto-povezana proteomička studija identificirala je ATPazu VCP/p97 kao glavnog partnera u interakciji IFITM3, čija inhibicija dovodi do defekata u lizozomskom sortiranju, prometu i kotransportu IFITM3 sa virusnim česticama 14 .Koristeći imunoprecipitaciju, identifikovali smo VAPA, protein povezan sa vezikulama, kao partnera u interakciji sa IFITM1/2/3 koji posreduje sazrevanje virusa posredovano holesterolom, a to je potvrđeno drugom studijom koja je koristila dvohibridni sistem kvasca.Naučna podrška 15 , 16 .
Osnovni biološki proces uključen u supresiju infekcije i malignu transformaciju je prezentacija antigena, koja je posredovana molekulima glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC).Peptidi (dužine 8-12 aminokiselina) iz cijepanih, prerano prekinutih ili pogrešno savijenih proteina se stavljaju u MHC-I heterodimer (koji se sastoji od MHC-I teških i lakih lanaca, nazvanih β-2-mikroglobulin; β2M) 17,18 .Dobijeni stabilni MHC-I trimeri se transportuju do površine ćelije, gde predstavljaju intracelularne peptide CD8+ T ćelijama (citotoksične T ćelije)17.T ćelije prepoznaju i uništavaju ove patogene i ćelije koje nose tumor-specifičan antigen.Posljedično, patogeni i tumorske stanice često potiskuju proces prezentacije antigena kako bi izbjegli imunološki nadzor.Osim toga, MHC-I je smanjen u 40-90% humanih tumora i često je povezan sa lošijom prognozom19.
Geni uključeni u odgovor na patogene moraju brzo prebaciti između stanja mirovanja i stanja aktivne transkripcije.Stoga se pretpostavlja da je nekoliko ćelijskih proteina uključeno u odgovor na visoku potražnju za IFN u kratkim vremenskim periodima, uključujući remodeliranje i modifikaciju promotorskog hromatina 20,21.Većina studija se fokusirala na identifikaciju pojedinačnih ISG proteinskih partnera u prisustvu IFN-a.Nekoliko proteomskih i transkriptomskih studija u modelnim ćelijskim sistemima razjasnilo je efekat IFN-a na ćelijski pejzaž.Međutim, uprkos rastućem razumijevanju dinamike izazvane interferonima, još uvijek znamo malo o uključenosti ISG-a.Kada se razmatra složenost i vremenski zavisna dinamika interferonske signalizacije, postavljaju se dva pitanja: (i) da li je moguće stabilizovati i uhvatiti multiproteinske komplekse uključene u brzu signalizaciju i (ii) da li se ove interakcije mogu mapirati u 3D prostor?
Da bismo se pozabavili ovim problemima, implementirali smo hemijsko umrežavanje (DSS) posredovano disukcinimidom suberatom zajedno sa masenom spektrometrijom (CLMS) da bismo proučavali IFNα-indukovanu mrežu interakcije proteina i njenu dinamiku.DSS dodaje kovalentne veze između proksimalnih ostataka proteina i/ili proteinskih kompleksa in vivo.Naknadna MS analiza otkriva specifična mjesta umrežavanja koja odražavaju prostornu blizinu regija unutar određenog proteina, nazvane unutrašnje veze, ili podjedinice u proteinskim kompleksima, koje se nazivaju međuodnosi.Koristeći ovaj pristup, identifikovali smo nekoliko novih proteinsko-proteinskih kompleksa, kao i interferonom izazvane multiproteinske mreže interakcija.Daljnjim testiranjem podskupa ovih novih interakcija, pokazujemo da H2BFS (H2B histonski tip FS; u daljem tekstu H2B) i MDN1 djeluju kao vezujući partneri za HLA-A.
Flo-1 ćelije su jedan od najpoznatijih in vitro modela adenokarcinoma jednjaka jer oponašaju ključne karakteristike tumora jednjaka22,23.Međutim, nisu svi tumori imunogeni, i da bismo utvrdili da li Flo-1 ćelije reaguju na tretman interferonom, tretirali smo Flo-1 ćelije sa 10 ng/ml IFNα tokom 72 sata.Flo-1 ćelije su pokazale ranu indukciju pSTAT1 i IRF1, počevši 2 sata nakon tretmana i nastavljajući 72 sata, sa vremenski zavisnim smanjenjem stacionarnih nivoa IRF1 (Slika 1A).Utvrđeno je da su ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 i ISG15) snažno inducirani nakon 6 sati, oponašajući klasične odgovore srednje i kasne faze na IFNα (slika 1A).Zajedno, ovi podaci sugeriraju da se ovaj ćelijski model može koristiti za proučavanje interferonskih odgovora.
Diferencijalni odgovori ekspresije proteina u Flo-1 ćelijama nakon tretmana IFNα.(A) Ekspresija proteina u Flo-1 ćelijama tretiranim sa 10 ng/ml IFNα tokom 2, 6, 24, 48 i 72 sata analizirana je imunoblotom korišćenjem naznačenih ISG antitela.(B) Coomassie plavom bojom SDS-PAGE gelovi ekstrakta celih ćelija nakon umrežavanja sa DSS za naznačena vremena i koncentracije.(C) Reprezentativni imunoblot ispitan sa p53(DO-1) antitelom iz istih uzoraka da bi se procenio stepen umrežavanja proteina.
Da bismo uhvatili pejzaž interakcije proteina in situ, koristili smo DSS, široko korišteno sredstvo za umrežavanje zbog njegove visoke propusnosti membrane i relativno kratkog vremena reakcije.Kraće vrijeme reakcije pomaže u sprječavanju stvaranja velikih agregata umreženih proteina, čime se održava stabilnost umreženog sredstva.Da bismo odredili optimalnu koncentraciju DSS-a i izbjegli prekomjerno umrežavanje, prvo smo izložili ćelije 5, 2,5 i 1 mM DSS-a na 5, 10, 5 i 30 minuta, respektivno, i analizirali lizate pomoću Coomassie obojenog SDS-PAGE. (podaci nisu prikazani) .Čini se da su ćelijski lizati visoko umreženi pri najnižoj koncentraciji iu najkraćoj vremenskoj tački.Stoga je DSS titriran na 1, 0,5 i 0,1 mM tokom 5 minuta (Slika 1B).Optimalno umrežavanje je primećeno sa 0,5 mM DSS tokom 5 minuta, a ovi uslovi su izabrani za ćelije tretirane IFNα.Osim toga, Slika 1C prikazuje Western blot izveden korištenjem antitijela p53 (DO-1) za procjenu stepena umrežavanja proteina.
Flo-1 ćelije su tretirane sa 10 ng/ml IFNα tokom 24 sata pre dodavanja unakrsnog povezivača.Umrežene ćelije su potom lizirane proteolizom u dva koraka, a proteini su obrađeni pomoću FASP (Slika 2)24,25.Umreženi triptični peptidi analizirani su masenom spektrometrijom (slika 2).MS/MS spektri se zatim usklađuju sa sekvencom proteina i kvantificiraju sa MaxQuant26,27.Umreženi peptidi su identifikovani iz dobijenih spektra korišćenjem SIM-XL programa, a pojedinačna jedinjenja su kombinovana u kompleksnu mrežu korišćenjem xQuest28 i SIM-XL29 softverskih cevovoda otvorenog koda (slika 2).SIM-XL identifikuje interakcije protein-protein, unutrašnje lance i pojedinačne lance u jednostavnim ili složenim mešavinama proteina i obezbeđuje skripte za vizualizaciju interakcija u proteinskim strukturama.Pored toga, svaku unakrsnu referencu rangira kao ID rezultat prema kvalitetu spektra MS/MS29.Identificirano je nekoliko visoko pouzdanih protein-protein interakcija i kompleksa, a novi skup interakcija je dalje istražen korištenjem ko-imunoprecipitacije i konformacijskih promjena kompleksa korištenjem modeliranja molekularne dinamike (MD) (slika 2) 30, 31.
Šematski prikaz CLMS metode.Flo-1 ćelije su tretirane sa 10 ng/ml IFNα tokom 24 sata, nakon čega je usledilo in situ umrežavanje proteina korišćenjem DSS, nakon čega je usledila ćelijska liza i tripsinizacija.Umreženi uzorci su analizirani korišćenjem Orbitrap masenog spektrometra i dalje uzorkovani za fragmentaciju peptidnih prekursora tokom LC-MS/MS.Dva povezana peptida su identifikovana iz dobijenih spektra korišćenjem programa Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL), a sva jedinjenja su kombinovana u kompleksnu mrežu korišćenjem kompjuterskih cevovoda.Filtrirajte interakcije niske pouzdanosti na osnovu rezultata lažno pozitivnih stopa (FDR).Nekoliko novih interakcija protein-protein visoke vjernosti dalje je potvrđeno korištenjem ko-imunoprecipitacije, a konformacijske promjene u kompleksima su ispitane korištenjem modeliranja molekularne dinamike (MD).
Ukupno ~30.500 i ~28.500 peptida je detektovano korišćenjem MaxQuant-a u nestimulisanim i stimulisanim uzorcima IFNα, respektivno (dodatna tabela S1, slika 3A).Distribucija dužine peptida u oba slučaja pokazala je veći udio većih peptida, što ukazuje na prisustvo umreženih peptida (slika 3B,C).Osim toga, veći udio većih peptida bio je prisutan u rasponu od 40-55 u uzorcima tretiranim IFNα (slika 3C).Mapiranje proteina u odnosu na intenzitet log2 pokazalo je da su klasični proteini stimulisani interferonom bili najzastupljeniji u poređenju sa netretiranim uzorcima, uključujući MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 i HLA-F (slika 3D).Analiza puteva za proteine ​​koji su više od tri puta obogaćeni kao odgovor na tretman IFNα koristeći Reactome bazu podataka puteva pokazala je da je MHC-I posredovana prezentacija antigena i obrada najdominantniji put (Slika 3E).U skladu s ranijim izvještajima, antivirusni odgovori posredovani OAS-om i ISG15, kao i signalizacija IFNα/β i citokina bili su među aktiviranim putevima.Pored toga, unakrsne veze proteina specifične za lizin i serin su identifikovane iz prvobitno dobijenih MS/MS spektra korišćenjem SIM-XL.Nedavna studija je izvestila o 104 ISG-a koji obuhvataju 20 virusa iz 9 klasa virusa meta-analizom pojedinačnih studija prekomerne ekspresije ISG-a u 5 tipova ćelija9.Međutim, da bismo prevazišli računska ograničenja skrininga velikih skupova podataka, počeli smo s manjim skupom podataka kako bismo istražili moguće interakcije između liste IRDS gena o kojima su objavili Padaria et al., od kojih su većina ISG.
Identifikacija različito eksprimiranih umreženih proteina kao odgovor na IFNα (podaci dobiveni od MaxQuant).(A) Vennov dijagram koji predstavlja broj uobičajenih i ekskluzivnih peptida identifikovanih u IFNα14 tretiranim i netretiranim Flo-1 uzorcima.Distribucija dužine peptida netretiranih (B) i IFNα tretiranih (C) umreženih uzoraka.(D) Toplotna mapa koja predstavlja log2 (intenzitet LFQ) između netretiranih i Flo-1 ćelija tretiranih IFNα14.Lijevi panel prikazuje proteine ​​koji se najaktivnije aktiviraju u prisustvu IFNα.(E) Histogram koji predstavlja 20 glavnih puteva obogaćivanja nakon tretmana IFNα.Baza podataka Reactome puta analizirala je više od četiri puta promjene u IFNα-reagirajućim proteinima.
Interferonom posredovana ISG stimulacija je dobro dokumentovana, ali na molekularnom nivou je slabo shvaćeno kako ovi proteini kulminiraju u širokom spektru bioloških funkcija.Istraživali smo interakcije proteina sa visokim stepenom pouzdanosti između poznatih ISG.Zanimljivo je da smo identifikovali mrežu koja uključuje MX1, USP18, ROBO1, OAS3 i STAT1 proteine ​​koji formiraju veliki kompleks kao odgovor na tretman IFNα (Slika 4, Tabela S2) 32,33,34.Najvažnije je da su ove interakcije pronađene u svim triplikatima tretiranim IFNα i nisu pronađene u netretiranim uzorcima, što sugerira da su nastale kao odgovor na liječenje IFNα.Poznato je da STAT1 transkripcijski reguliše ekspresiju ovih ISG, ali njegova interakcija sa ISG na nivou proteina nije proučavana.Kristalna struktura STAT1 pokazala je da njegov spiralni domen (CCD) nije uključen u interakciju sa DNK ili protomerima tokom formiranja dimera35.Ove α-heliksa formiraju spiralnu strukturu spirale koja pruža pretežno hidrofilnu površinu za interakciju 35 .U našim CLMS podacima, uočili smo da se većina interakcija sa STAT1 dogodila u SH2 domeni koja prethodi CCD-u, linker domeni ili C-terminalnom repu (ostaci 700-708) (Slika 4A).Prethodna studija je objavila da se USP18 vezuje za CCD i DNK-vezujući domen (DBD) STAT2 i regrutuje se za podjedinicu interferonskog receptora tipa I IFNAR2 da posreduje u inhibiciji signalizacije interferona tipa I 24 .Naši podaci su također pokazali da USP18 katalitički domen interagira sa STAT1 DBD (Slika 4A,D), sugerirajući da i STAT1 i STAT2 mogu igrati ulogu u privlačenju USP18 u IFNAR2.
Protein-proteinska ISG mreža identificirana u umreženim stanicama tretiranim IFNα.(A) 2D dijagram interakcije koji prikazuje interakcije protein-protein (generisane u SIM-XL programu), sa linijama koje predstavljaju intermolekularne interakcije (prekidna veza postavljena na 3,5).Bojom su označeni domeni različitih identiteta32: MX1 domen, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) i GED (569–660).OAS3 domeni: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) i OAS1_C (903-108).Domena ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) i fn3 (777–864).STAT1 polja: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) i STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Kružni preglednik umreženih proteina (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 i STAT1) sa interakcijama i interakcijama označenim plavom i crvenom bojom.Prag unakrsne veze postavljen je na 3,5.Tačkasti grafikoni ukazuju na STAT1 interakcijska mjesta sa MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) i OAS3 (F), kao i mjesta interakcije K ili S između dva peptida.Na slici je prag rezultata unakrsne veze postavljen na 3,0.(G) Različita mjesta interakcije između STAT1 i OAS3 DI domena superponiranih na njihove proteinske strukture u PyMol (PyMOL molekularni grafički sistem, verzija 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) i OAS3 (pdb id: 4s3n34).) program.
Kod ljudi su opisane dvije izoforme USP18, protein pune dužine koji se pretežno nalazi u jezgru i izoforma bez N-terminalnog domena, USP18-sf, koja je ravnomjerno raspoređena u citoplazmi i jezgru 36 .Osim toga, predviđeno je da je N-terminus nestrukturiran i da ne zahtijeva aktivnost izopeptidaze ili vezivanje ISG1537.Većina interakcija identificiranih u našoj studiji bila je locirana na N-terminusu proteina, što sugerira da ove interakcije uključuju USP18 pune dužine (Slika 4A,D) i stoga se vjerovatno javljaju u jezgru.Štaviše, naši podaci takođe ukazuju na to da je N-terminus specijalizovan za interakcije protein-protein.Vezivno mesto IFNAR2 nalazi se između ostataka 312-368, i posebno, nijedan od proteina u kompleksu se ne vezuje za ovaj region (Slika 4A) 37,38.Ovi podaci zajedno pokazuju da IFNAR2 vezujući domen koristi isključivo protein receptora.Osim toga, otkriveno je da su samo OAS3 i ROBO1 povezani sa domenima uzvodno od N-terminusa i mjesta vezivanja IFNAR2 (Slika 4A).
ROBO1 pripada superfamiliji imunoglobulina (Ig) transmembranskih signalnih molekula i sastoji se od pet Ig domena i tri domena fibronektina (Fn) u ekstracelularnoj regiji.Ove ekstracelularne domene prate membransko-proksimalni region i jedna transmembranska spirala 39. Nestrukturirana intracelularna regija se nalazi na C-terminusu i sadrži motive očuvane sekvence koji posreduju u vezivanju efektorskih proteina39.Područje koje se proteže od aminokiselina ~1100 do 1600 je uglavnom poremećeno.Otkrili smo da MX1 interaguje sa ROBO1 preko Ig, Fn i intracelularnih domena, dok se većina interakcija sa STAT1 dešava između njegovog CCD-a, linker domena i C-terminusa ROBO1 (Slika 4A,E).S druge strane, interakcije sa DI, DIII i OAS3 linker regionima su raspoređene kroz ROBO1 protein (slika 4A).
Familija proteina oligoadenilat sintaze (OAS) prihvata i vezuje intracelularnu dvolančanu RNK (dsRNA), podvrgava se konformacionim promenama i sintetiše 2′,5′-povezane oligoadenilate (2-5 As) 40 .Utvrđeno je da među tri OAS-a, OAS3 pokazuje najveći afinitet za dsRNA i sintetizira najmanju količinu 2-5 As, koji može aktivirati RNazu L i time ograničiti replikaciju virusa 41 .OAS familija se sastoji od domena nukleotid transferaze sličnih polimerazi beta (pol-β).Prethodna istraživanja su pokazala da katalitička aktivnost C-terminalnog domena (DIII) ovisi o dsRNA-vezujućoj domeni (DI), koja je potrebna za aktivaciju OAS342.Uočili smo da DI i DII domeni OAS3 stupaju u interakciju sa CCD i malim spojnim područjem između SH2 i STAT1 TAD (Slika 4A,F).Preklapanje različitih mjesta za umrežavanje na strukturi proteina otkrilo je interakciju između β-lista i DBD STAT1 petlje i otvorenog džepa ili šupljine formirane od ostataka 60-75 u DI domeni OAS3 (slika 4G).Orijentacija proteina u kompleksu je takođe pokazala da nijedna od interakcija sa OAS3 nije ometala sposobnost vezivanja DNK njegovog DI domena (slika S1A).Pored toga, N-terminalni domen GTPaze MX1 u velikoj meri interaguje sa DI i DIII domenima OAS3 (slika 4A).Takođe smo primetili interakciju između OAS1 i MX1 u sva tri ponavljanja tretirana IFNα, gde je jedan OAS1 domen (takođe katalitički aktivan) stupio u interakciju sa sva tri MX1 domena (Slika S2A,B).
MX proteini su dio velike porodice GTPaza sličnih dineinu koje sadrže N-terminalni GTPazni domen koji veže i hidrolizira GTP, posredni domen koji posreduje u samosastavljanju i C-terminalni leucinski zatvarač koji djeluje kao GTPaza (LZ ).domen efektor domen25,43.MX1 se vezuje za podjedinice virusnih polimeraza kako bi blokirao transkripciju virusnog gena43.Ranije prijavljeni dvohibridni pregled kvasca pokazao je da MX1 povezan sa PIAS1 inhibira STAT1 posredovanu aktivaciju gena blokiranjem aktivnosti vezivanja DNK i takođe ima aktivnost SUMO E344,45 ligaze.Ovdje pokazujemo da se MX1 veže za STAT1 (Slika 4C,D), međutim kako ova interakcija utječe na STAT1 posredovanu aktivaciju gena kao odgovor na IFNα treba dalje proučavati.Pored toga, takođe smo otkrili da je MX1 interagovao sa IFIT3 i DDX60 u sva tri ponavljanja tretirana IFNα (slika S2C).
DDX60 je IFN-indukovana citoplazmatska helikaza za koju je ranije prijavljeno da igra ulogu u RIG-I nezavisnoj degradaciji virusne RNA46.On stupa u interakciju sa RIG-I i aktivira njegovu signalizaciju na ligand-specifičan način 46. DDX60 se sastoji od DEXD/H-Box helikazne domene i C-terminalnog helikaznog domena koji vezuju virusnu RNK i DNK47.Većina njegovih interakcija sa MX1 i IFIT3 odvija se unutar dugih N- i C-terminalnih regiona bez kanonskih domena ili motiva (slika S2E,F).Međutim, MX1 je takođe povezan sa domenom helikaze DEXD/H-Box (slika S2E).Proteini iz IFIT porodice imaju tandem kopije karakterističnog motiva spirala-zavoj-zavojnica nazvanog tetrapeptidni ponavljanje (TPR).Utvrđeno je da je IFIT3 pozitivan modulator RIG-I signalizacije i stoga komponenta MAVS kompleksa.Uzeti zajedno, naši podaci sugeriraju da IFIT3 i DDX60 međusobno djeluju prvenstveno u regiji između TPR 3-6 IFIT3 i da mogu igrati ulogu u RIG-I/MAVS signalizaciji (slika S2F).
S obzirom na to da je skrining cijelog proteoma računski intenzivan, onda smo pregledali cijelu UniProt bazu podataka ljudi na prisustvo jednog od ponavljanja tretiranih IFNα.U ovoj replici smo pronašli nekoliko vrlo pouzdanih interakcijskih mreža za HLA-A.Analiza proteinskih puteva identifikovanih MS/MS spektrima pokazala je da je procesiranje i prezentacija antigena zasnovana na MHC-I glavni put induciran interferonom (slika 3D).Stoga smo se fokusirali na proučavanje proteinskih interakcija MHC-I molekula sa visokim stepenom pouzdanosti u svim umreženim uzorcima.HLA se sastoji od α1, α2 i α3 domena i lakih lanaca, a mikroglobulin β2 (β2m) je konstantni šaperon protein49.Jednom sklopljena u endoplazmatskom retikulumu, HLA je nestabilna u odsustvu peptidnih liganda50.Žljeb koji se vezuje za peptide formiraju visoko polimorfni i nestrukturirani α1 i α2 domeni u nepeptidnom obliku i relativno manje polimorfni α351 domen.U prisustvu IFNα, detektovali smo dva HLA-A kompleksa: jedan je u interakciji sa HMGA1 i H2B (Slika 5, Tabela S3), a drugi je u interakciji sa MDN1, LRCH4 i H2B (Slika 6).
IFNα indukuje HLA-A interakcijsku mrežu sa H2B (H2BFS) i HMGA1.(A) 2D dijagram (generisan u SIM-XL softveru) koji prikazuje različite vrste interakcija u kompleksu H2B-HLA-A-HMGA1: međuveza (plava), međuveza (crvena) i jedna veza (crna)..Domeni različitih identiteta označeni su bojama32: H2B (histon; 2–102) i MHC-I (MHC_1; 25–203, grupa C1; 210–290 i MHC_I_C; 337–364).Prag unakrsne veze postavljen je na 3,5.Tačkasti grafikoni pokazuju mesta interakcije HLA-A sa H2B (B) i HMGA1 (C), kao i mesta interakcije K ili S između dva peptida.Na slici je prag rezultata unakrsne veze postavljen na 3,0.(D) Odnosi između proteina prikazanih u strukturama proteina H2B, HLA-A i HMGA1 u programu PyMOL.Ove strukture su modelovane pomoću Phyre2 servera (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2), a strukture šablona za proteine ​​H2B, HLA-A i HMGA1 bile su 1kx552, 1kj349 i 2eze55, respektivno.
IFNα indukuje HLA-A interakcijsku mrežu sa H2B (H2BFS), MDN1 i LRCH4.(A) Intramolekularne (crvene) i intermolekularne (plave) poprečne veze predstavljene na 2D interaktivnoj mapi (generisanoj u SIM-XL softveru) sa MDN1 predstavljenim kao krug.Prag unakrsne veze postavljen je na 3,5.Domeni različitih identiteta označeni su bojama32: H2B (histon; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grupa C1; 210–290 i MHC_I_C; 337–364) i LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) i CH (535–641)).(B) Odnosi između proteina prikazanih u strukturama proteina H2B, HLA-A, LRCH4 i MDN1 u programu PyMOL.Ove strukture su modelovane pomoću Phyre2 servera (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) sa šablonskim strukturama 1kx552, 1kj349, 6hlu62 i 6i2665 za proteine ​​H2B, HLA-A, LRCH4 i MDN1, respektivno.Tačkasti grafikoni koji prikazuju mjesta interakcije K ili S za HLA-A sa H2B (C), LRCH4 (D) i MDN1 (E).Za dijagrame, prag rezultata unakrsne veze je postavljen na 3,0.
Osim održavanja integriteta genoma, histon H2B je također uključen u regulaciju transkripcije.H2B protein se sastoji od centralnog histonskog domena (HFD) formiranog od tri α-heliksa odvojene petljama i C-terminalnog repa 41,52.Većina interakcije sa H2B odvija se u α1 spirali, koja obezbeđuje trimerizaciju sa HFD heterodimerom (slika 5A,B).Iako su lizini uključeni u vezivanje DNK, neki lizini su također alternativna mjesta za acetilaciju ili metilaciju.Na primjer, ostaci K43, K46 i K57 iz H2B nisu uključeni u direktno vezivanje DNK, ali su mete različitih post-transkripcijskih modifikacija53.Slično, ostaci K44, K47 i K57 u H2B mogu igrati alternativnu ulogu u prisustvu IFNα, uključujući interakcije sa drugim proteinima (Slika 5A, B).Osim toga, ekstrakromosomski histon H2B aktivira imuni odgovor u različitim tipovima stanica, djelujući kao citosolni senzor za otkrivanje fragmenata dvolančane DNK (dsDNA) izvedene iz infektivnih agenasa ili oštećenih stanica54.U prisustvu DNK virusa, smanjenje H2B inhibira proizvodnju IFN-β i fosforilaciju STAT154.Takođe je poznato da se H2B kreće unutra i izlazi iz nukleusa brže od drugih histona jezgra54.Interakcije H2B sa MDN1 i LRCH4 takođe su primećene u odabranim netretiranim uzorcima.Otkrili smo da je HLA-A stupio u interakciju sa H2B u sva tri uzorka tretirana IFNα i u jednom netretiranom ponovljenom uzorku.Ovi podaci odražavaju ulogu H2B u alternativnoj fiziološkoj funkciji neovisnoj o regulaciji transkripcije.
HMGA1 (high mobility group AT-Hook 1), mali nukleoprotein bogat aminokiselinama koje promovišu bolest, identificiran je u vezi s HLA-A.Ima kiseli C-terminalni rep i tri različita DBD-a nazvana AT kuke jer se vezuju za manji žljeb AT-bogatog regiona u dsDNA55,56.Ovo vezivanje uzrokuje savijanje ili ispravljanje DNK, omogućavajući kanonskim faktorima transkripcije da pristupe njegovoj konsenzus sekvenci.Vjeruje se da je C-terminalni rep uključen u interakcije protein-protein i regrutaciju transkripcijskih faktora, budući da mutanti C-terminalne delecije nisu u stanju da iniciraju transkripciju57.Štaviše, ovaj domen sadrži nekoliko konzerviranih mjesta fosforilacije koja su poznati supstrati za kinaze 58 .Primetili smo interakcije HLA-A i H2B sa HMGA1 izvan C-terminalnog domena, što sugeriše da se C-terminalni domen uglavnom koristi za vezivanje faktora transkripcije (Slika 5A, C).HMGA proteini se takmiče sa histonom H1 za vezivanje za DNK adaptera, čime se povećava dostupnost57.Slično, čini se vjerojatnim da HMGA stupa u interakciju sa histonom H2B duž DNK linkera u konkurenciji sa histonom H1.HMGB1 inducira ekspresiju HLA-A, -B i -C u dendritskim ćelijama, što dovodi do njihove aktivacije59, ali interakcija između HMG i HLA nije ranije prijavljena.Otkrili smo da HMGA1 stupa u interakciju sa α1 i α3 domenima HLA-A, sa većinom interakcija izvan njegovih 3 DBD (Slika 5A,C).U našim rukama je otkriveno da je HLA-A lokalizovan u jezgru (podaci nisu prikazani), a s obzirom da su H2B i HMGA1 takođe prisutni u jezgru, ova interakcija se verovatno dešava u jezgru.Specifični adukti izmjereni između H2B, HLA-A i HMGA1 prikazani su na slici 5D.
Većina interakcija HLA-A sa drugim proteinima se dešava unutar njegovih α1 i α2 domena i poremećenog C-terminalnog domena (slika 6).U jednom od ovih primjera otkrili smo da HLA-A stupa u interakciju s neuređenim N-terminalnim repom LRCH4 (slika 6A,D).LRCH4 reguliše aktivaciju TLR4 i indukciju LPS citokina, modulirajući na taj način urođeni imuni odgovor60,61.To je membranski protein sa devet ponavljanja bogatih leucinom (LRR) i homološkim motivom kalmodulina (CH) u svom ektodomenu, nakon čega slijedi transmembranski domen (TMD) 60, 62 .Izvještava se da CH domeni posreduju u interakcijama protein-protein 60 .Deo od oko 300 aminokiselina između LRR i CH domena je relativno dostupan, ali neuređen.Na osnovu funkcije poremećenih regija kao medijatora proteinsko-proteinskih mreža i vezikularnog transporta 63 , otkrili smo da se većina proteinskih interakcija događa u poremećenim regijama.Interakcije sa MDN1 bile su raspoređene po celoj dužini proteina, uključujući LRR1, LRR6, CH domene i nasumične regione, dok je H2B uglavnom vezan za CH domen (Slika 6A, B).Značajno je da nijedna od interakcija nije uključivala TMZ, što ukazuje na specifičnost CLMS pristupa (Slika 6A, B).
MDN1 je također identificiran kao dio HLA-A proteinske mreže (slika 6A).Pripada AAA porodici proteina (ATPaze povezane sa različitim aktivnostima).Ovo je isti N-terminalni AAA domen koji se organizira u heksamerni prsten i uklanja faktor sklapanja iz 60S 64 ribosomalne podjedinice.izgleda da je sličan dyneinu64,65,66.Pored toga, region bogat Asp/Gluom je praćen MIDAS domenom (mesta zavisna od metalnih jona).Zbog velike veličine MDN1 (otprilike 5600 aminokiselina) i njegove ograničene homologije s dobro proučenim proteinima, malo se zna o njegovoj strukturi i funkciji kod ljudi.Identifikovali smo HLA-A, H2B i LRCH4 kao partnere za vezivanje MDN1 i otkrili njihovu orijentaciju kao proteinski kompleksi u PyMol (slika 6A,B).Ova tri proteina stupaju u interakciju sa AAA domenom, linker domenom sličnim dineinu i možda MIDAS MDN1 domenom.U prethodnom izvještaju, afinitetno pročišćavanje proteina mamaca identificiralo je MDN1 kao protein povezan s histonom H2B67.Osim toga, nedavna studija je također izvijestila o interakciji između MDN i HLA-B u HCT116 stanicama koristeći afinitetno pročišćenu masenu spektrometriju, podržavajući naše nalaze68.Identifikacija ovog kompleksa u uzorcima tretiranim IFNα sugerira ulogu MDN1 u interferonskoj signalizaciji.
Budući da su HLA geni visoko polimorfni, izdvojili smo sekvenciranje očitavanja mapiranja HLA-A, -B i -C iz podataka sekvencioniranja RNK ćelija Flo-1 (podaci nisu prikazani).Peptidne sekvence u skladu sa očitavanjem sekvenciranja otkrile su značajne razlike između HLA-A, -B i -C u regijama u kojima su umreženi peptidi bili locirani u HLA-A (slika S3).Osim toga, nismo uočili unakrsno povezivanje proteina na protein HLA-B/C molekula sa H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 proteinima.Ovo sugerira da je interakcija proteina pronađena između HLA-A, MDN1, LRCH1 i HMGA1 specifična za HLA-A.Pored toga, proteomska analiza ne-povezanih uzoraka (Tabela S4) pokazala je da HLA-A ima veću pokrivenost sekvence u poređenju sa HLA-B ili HLA-C.Peptidi identificirani za HLA-A bili su visokog intenziteta u uzorcima tretiranim IFNα i u netretiranim uzorcima.
Kako bismo osigurali da interakcije identificirane ovdje nisu uzrokovane nespecifičnim umrežavanjem dva proteina u neposrednoj prostornoj blizini, dodatno smo potvrdili dva nova HLA-A faktora interakcije izvođenjem ko-imunoprecipitacijskih testova.Interakcije HLA-A sa endogenim MDN1 i H2B otkrivene su iu IFNα-tretiranim i u netretiranim Flo-1 ćelijama (Slika 7, Slika S4).Potvrdili smo da je HLA-A uhvaćen od strane H2B u imunoprecipitatima i da je ova povezanost nastala zbog tretmana IFNα jer je HLA-A bio odsutan u uzorcima imunoprecipitata iz neobrađenih ćelija (Slika 7A).Međutim, naši podaci sugeriraju da IFNα različito reguliše HLA-A vezivanje za H2B i MDN1.IFNα inducira povezanost između H2B i HLA-A, ali smanjuje njegovu povezanost s MDN1.Otkrili smo da je MDN1 bio povezan sa HLA-A u kontrolama, a dodavanje IFNα smanjilo je ovu interakciju nezavisno od indukcije MDN1 IFNα (Slika 7B,C).Pored toga, HLA-A imunoprecipitacija uhvatila je H2B u A549 ćelijama (slika S4), što sugeriše da je ova interakcija nezavisna od tipa ćelije.Uzeti zajedno, ovi rezultati podržavaju interferonom posredovane interakcije HLA-A sa H2B i MDN1.
HLA-A zajedno pročišćava H2B i MDN1.Reprezentativni endogeni H2B (A) i MDN1 (B) imunoblotovi su imunoprecipitirani iz Flo-1 ćelija tretiranih IFNα i ispitani na navedena antitijela.Kao negativna kontrola korišteni su mišji i zečji IgG.(C) Relativne količine (unos) različitih antigena su prikazane imunoblotovima ispitanim protiv indiciranih antitijela, β-aktin je korišten kao kontrola opterećenja.
Istražena su strukturna svojstva jedne od visoko pouzdanih umreženih mreža izazvanih interferonom, H2B-HLA-A-HMGA1.Koristili smo modeliranje molekularne dinamike kao alternativni pristup za razumijevanje konformacijske dinamike proteina uključenih u ovaj kompleks (slika 8).Zaključci iz CLMS podataka ukazuju na mogućnost različitih konformacija proteina H2B, HLA-A i HMGA1.Stoga su sljedeći potencijalni kompleksi modelirani u mediju rastvarača: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A i H2B-HLA-A-HMGA1.Početni ekran za spajanje proteina i proteina koristeći MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) paket je predložio moguće konformacije koje se razlikuju između ovih proteina (slika 8A).Vizualizacija kompleksa proteina za spajanje otkrila je nekoliko interakcija i mogućih konformacija (Slika 5A, 8).Dakle, jedna moguća konformacija je prikazana na slici 8A (sa označenim poprečnim vezama) i dalje je procijenjena korištenjem MD modeliranja.Pored toga, vezivanje H2B ili HMGA1 za HLA-A naglašava veći afinitet H2B za HLA-A (slika 8A).
Konformaciona dinamika mogućih mreža između kompleksa H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A i H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Lijevi panel je 2D mapa (generirana u SIM-XL softveru) intramolekularnih (crvena) i intermolekularnih (plava) unakrsnih veza (prekid umrežavanja postavljen na 3,5).Osim toga, identificirani ostaci umrežavanja označeni su na strukturama proteina H2B, HLA-A i HMGA1.Povezane konformacije ovih proteina ekstrahovane su korišćenjem docking pipeline-a implementiranog u MOE paketu.Donji levi panel prikazuje različite moguće konformacije kompleksa H2B-HLA-A i HMGA1-HLA-A sa različitim afinitetima vezivanja protein-protein (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Standardna devijacija (RMSD) atomskih pozicija (isključujući atome vodonika) za svaku strukturu proteina.(C) Intermolekularne interakcije protein-protein vodonične veze iz različitih simuliranih kompleksa uzimajući u obzir specifične interakcije u trajanju ≥ 10 ns.Granična udaljenost donor-akceptor h veze je postavljena na 3,5 Å, a granični ugao donor-H-akceptor je postavljen na ≥ 160°–180°.(D) Obilježeni ostaci koji formiraju HLA-A protein-protein interakcije sa svojim odgovarajućim partnerima, u rasponu od ≥ 20 ns, ekstrahirani iz lažnih HLA-A-H2B i HLA-A-HMGA1 kompleksa.Proteinske strukture predstavljaju prosječnu strukturu od 100 ns MDS.(E) Interakcije između HLA-A-H2B i HLA-A-HMGA1 kompleksa u poređenju sa interakcijama praćenim H2B-HLA simulacijom tokom 100 ns na osnovu K ili S interakcijskog mjesta između dva peptida.Kompleksi /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Vrijednost praga za procjenu unakrsnih veza postavljena je na 3,0, a uzete su u obzir specifične interakcije iz MDS-a koje su uzimale ≥ 10 ns.Proteinske strukture su vizualizirane korištenjem paketa BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, SAD) i Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).
Stabilnost HLA-A molekula tokom vremena (standardna devijacija; RMSD ili standardna devijacija; RMSF) ukazuje da je prisustvo H2B ili HMGA1 proteina u kompleksima stabilizovalo HLA-A (Slika 8B, Slika S5).HMGA1 protein se čvrsto vezuje za B2M mesto HLA-A, izazivajući stabilnost HLA-A aminokiselina u kompleksu HLA-A-HMGA1 ili H2B-HLA-A-HMGA1 (Slika 8B, Slika S5).posebno je utvrđeno da su HLA ostaci ~60-90 i ~180-210 manje fleksibilni u prisustvu H2B (Slika 8B).H2B i HMGA1 su pokazali bolje vezivanje za HLA-A u kompleksu H2B-HLA-A-HMGA1 u poređenju sa HLA-A vezivanjem samo za H2B ili HMGA1 (Slika 8C,D; Tabela S5).Ostaci uključeni u vodoničnu vezu (MD modelirana visoka zauzetost ≥ 10 ns) poklapaju se sa mjestima interakcije CLMS (K ili S ostaci) u kompleksu, što sugerira da su interakcije identificirane pomoću CLMS-a vrlo pouzdane.Pouzdanost (slika 8E).U CLMS i MD modeliranju, pronađeno je da HLA-A ostaci između oko 190-210 i oko 200-220 amino kiselina vezuju H2B i HMGA1 (Slika 8E).
Interakcije protein-protein formiraju dinamičke strukturne mreže koje posreduju unutarćelijsku komunikaciju kao odgovor na određene podražaje.Budući da mnogi proteomički pristupi otkrivaju promjene u ukupnom stabilnom nivou proteina, dinamika interakcije protein-protein zahtijeva dodatne alate za hvatanje interfejsa vezivanja, a CLMS je jedan takav alat.Interferonski signalni sistem je citokinska mreža koja omogućava ćelijama da odgovore na niz patogenih i intrinzičnih patoloških signala iz okoline, što kulminira indukcijom podskupova proteina inducibilnih interferonom.Primijenili smo CLMS da utvrdimo da li se nove interakcije protein-protein mogu identificirati među panelom proteina induciranih interferonom.Globalna analiza umrežavanja proteina u modelu Flo-1 ćelija koji reaguje na interferon korišćena je za hvatanje proteinskih kompleksa.Ekstrakcija triptičnih peptida iz ne-povezanih i umreženih ćelija omogućava brojanje peptida, obogaćivanje puteva i distribuciju dužine peptida sa definisanim LFQ intenzitetom.Kanonski interferon inducibilni proteini identifikovani su kao pozitivna unutrašnja kontrola, dok su uočeni novi intermolekularni i intramolekularni umreženi adukti kanonskih interferonom inducibilnih proteina kao što su MX1, UP18, OAS3 i STAT1.Istražene su različite strukturne karakteristike i interakcije u funkcionalnim područjima.
Interakcija između HLA-A, MDN1 i H2B otkrivena je imunoblotingom u Flo-1 i A549 ćelijama tretiranim i netretiranim IFNα.Naši rezultati ističu da se HLA-A kompleksi sa H2B na IFNα ovisan način.Naš rad predstavlja zanimljiv put za dalja istraživanja ko-lokalizacije ova dva kompleksa.Također bi bilo interesantno proširiti CLMS pristup na panel ćelijskih linija kako bi se identificirale interakcije proteina posredovane interferonom neovisne o tipu ćelije.Konačno, koristili smo MD modeliranje kao alternativni pristup za razumijevanje konformacijske dinamike proteina uključenih u kompleks H2BFS-HLA-A-HMGA1, koji je pratio intramolekularne i intermolekularne unakrsne razgovore.Zaključci iz CLMS podataka ukazuju na mogućnost različitih konformacija proteina H2BFS, HLA-A i HMGA1.Moguće različite konformacije između ovih spojnih proteinskih kompleksa otkrile su nekoliko interakcija sličnih onima uočenim u skupu podataka CLMS.Jedna od glavnih prednosti naše metode je da omogućava laku identifikaciju visoko polimorfnih gena u interakciji kao što je HLA, tako da će biti zanimljivo proučavati interakcije proteina specifičnih za HLA haplotip koje je inače teško proučavati.Uzeti zajedno, naši podaci pokazuju da se CLMS može koristiti za proširenje našeg razumijevanja signalnih mreža induciranih interferonom i pružiti osnovu za proučavanje složenijih međućelijskih sistema u mikrookruženju tumora.
Flo-1 ćelije su dobijene iz ATCC i održavane u DMEM (Gibco) sa dodatkom 1% penicilina/streptomicina (Invitrogen), 10% fetalnog goveđeg seruma (Gibco) i čuvane na 37°C i 5% CO2.Inkubacija.Ćelije su uzgojene do 70-80% konfluencije prije nego što su tretirane IFNα14 (proizveden od strane Edinburgh Protein Production Facility).Sve ostale hemikalije i reagensi su kupljeni od Sigma Aldrich osim ako nije drugačije naznačeno.
Flo-1 ćelije su uzgajane u pločama sa 6 jažica i sledećeg dana ćelije su tretirane sa 10 ng/ml IFNα14 tokom 24 sata do približno 80% konfluencije.Ćelije su isprane tri puta sa PBS-om i vezane sa svježe pripremljenim DSS-om (Thermo Fisher Scientific) (otopljenim u DMSO) u PBS-u 5 minuta na 37°C do konačne koncentracije od 0,5 mM.Reakcija DSS umrežavanja je zamenjena sa PBS i rezidualni DSS je ugašen dodavanjem 20 mM Tris (pH 8,0) u PBS tokom 15 minuta na 37°C.Ćelije su sakupljene struganjem i sakupljene u epruvete sa malim vezivanjem (Axygen).
Ćelijska peleta je lizirana sa 300 µl pufera za lizu uree (8 M urea, 0,1 M Tris, pH 8,5) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi uz povremeno mućkanje.Svi koraci centrifugiranja izvedeni su na 14,000 xg na 8°C.Centrifugirajte lizat 10 minuta i prenesite supernatant u novu epruvetu.Preostale bistre čestice su otopljene u 150 μl drugog pufera za lizu (2 M urea, 2% (w/v) SDS (natrijum dodecil sulfat)) tokom 30 minuta ili više dok se ne dobije homogena vodena otopina.Lizat je centrifugiran 20 minuta i supernatant je pomiješan sa lizatom dobivenim u prethodnom koraku.Koncentracije proteina su procijenjene korištenjem Micro BCA testa (Thermo Fisher Scientific) prema uputama proizvođača za postupke mikroploče.Uzorci su brzo zamrznuti u tečnom azotu i čuvani na -80°C.
Približno 100 μg rastvorljivog umreženog proteina obrađeno je korištenjem modificiranog protokola za pripremu uzorka filtracije (FASP) kako su opisali Wisniewski et al.69 Ukratko, protein je umrežen sa 200 µl urea pufera (8 M urea u 0,1 M Tris, pH 8,5), vorteksiran i prepolovljen.Svi koraci centrifugiranja izvedeni su na 14,000 xg na 25°C.Prva polovina umreženog proteinskog lizata je prebačena u 10 kDa Microcon centrifugalni filter uređaj opremljen Ultracel-10 membranom (Merck), nakon čega je uslijedilo centrifugiranje na filteru 25 minuta.Zatim dodajte drugu polovinu proteina u filter i ponovite iste korake.Obnavljanje proteina je izvedeno dodavanjem 100 μl 17 mM tris(2-karboksietil)fosfin hidrohlorida (TCEP) u puferu uree.Recovery je miješan na termomikseru na 600 rpm tokom 30 minuta na 37°C.Dodatno, kolona je centrifugirana i reducirani umreženi protein je alkiliran korištenjem 100 μl 50 mM jodoacetamida u puferu uree.Reakcija alkilacije je izvedena na sobnoj temperaturi 20 minuta u mraku.Rotirajte kolonu, operite zidove kolone 3 puta sa 100 µl pufera uree, a zatim centrifugirajte.Ista operacija je izvedena 3 puta sa 100 μl 100 mM amonijum bikarbonata.Prije tripsinizacije zamijenite sabirnu cijev novom.Dodajte pufer za varenje koji sadrži 50 mM amonijum bikarbonata i 1 µl tripsina razrijeđenog u tripsin puferu (Promega).Omjer tripsina i proteina je održavan na oko 1:33, a reakcije varenja su inkubirane preko noći na 37°C u vlažnoj komori.Umreženi peptid je eluiran iz filtera centrifugiranjem 25 minuta.Oporavak peptida je poboljšan dodavanjem 50 μl 0,5 M NaCl u filter, nakon čega je uslijedilo centrifugiranje 25 minuta.
C18 Micro Spin kolone (Harvard Apparatus) korišćene su za odslađivanje umreženih triptičnih peptida prema protokolu koji su opisali Bouchal et al.70 uz manje modifikacije.Ukratko, C18 spin kolone su aktivirane sa tri ispiranja 0,1% mravlje kiseline (FA) u acetonitrilu (AcN) (Merck) i dva ispiranja 0,1% FA.Kolona je hidrirana sa 0,1% FA tokom 15 minuta.Ubacite uzorke u centrifugirane kolone i operite 3 puta sa 0,1% FA.Osoljeni peptidi su sekvencijalno eluirani postupnim gradijentom koristeći 50%, 80% i 100% AcN u 0,1% FA.Uzorci su sušeni u SpeedVac Plus koncentratoru (Eppendorf) sve dok zaostala tečnost nije potpuno nestala.Eluirani peptidi su rastvoreni u 100 μl 0,08% trifluorosirćetne kiseline u 2,5% AcN i koncentracije su merene na NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Otprilike 1 μg umreženog peptida po uzorku je ubrizgano u LC-MS/MS sistem.
Umreženi peptidi su razdvojeni na UltiMate 3000 RSLCnano LC sistemu (Thermo Scientific) spojenom na Orbitrap Exploris 480 maseni spektrometar (Thermo Scientific).Umreženi peptidi su sakupljeni na 300 µm ID, 5 mm dugoj µ-pre-koloni C18 capture kolone napunjenoj C18 PepMap100 sorbentom i 5 µm PepMap sorbentom (Thermo Scientific).Učitajte set za protok pumpe na 5 µl/min 0,08% trifluorosirćetne kiseline rastvorene u 2,5% AcN.Umreženi peptidi su odvojeni na analitičkoj koloni fuzionisanog silicijum-dioksida unutrašnjeg prečnika 75 μm i dužine 150 mm, napunjenoj sa 2 μm PepMap sorbentom (Thermo Scientific).Mobilne faze A i B sastojale su se od 0,1% FA u vodi i 0,1% FA u acetonitrilu, respektivno.Gradijent počinje od 2,5% B i raste linearno na 40% B tokom 90 minuta, a zatim na 90% B u naredne 2 minute.Sastav mobilne faze je održavan na 90% B tokom 10 minuta, a zatim se linearno smanjio na 2,5% B tokom 2 minuta.Kolona je bila uravnotežena na 2,5% B tokom 8 minuta pre sledećeg ciklusa.Umreženi peptidi eluirani iz analitičke kolone ionizirani su u izvoru jonizacije nanoelektrospreja (NSI) i ubrizgani u Exploris 480 maseni spektrometar (Thermo Scientific).
Maseni spektrometar Orbitrap Exploris 480 radio je u režimu pozitivne korelacije podataka.Potpuno skeniranje je obavljeno u režimu sekcije pri rezoluciji od 120.000 sa postavkama opsega od m/z 350 Th do m/z 2000 Th.Normalizovani AGC cilj je postavljen na 300% sa maksimalnim ulaznim vremenom od 50ms.Monoizotopska detekcija pikova je uspostavljena za peptide.Parametar opuštanja ograničenja postavlja se na true ako se pronađe premalo prekursora.Minimalna jonska snaga prekursora je postavljena na 5.0e3, a stanja naelektrisanja prekursora do +8 su uključena u eksperimente.
Vrijeme ciklusa između glavnih skeniranja u modu korelacije podataka postavljeno je na 2,5 sekunde.Dinamičko isključenje mase postavljeno je na 20 s nakon prve fragmentacije iona prekursora.Prozor izolacije prekursora je postavljen na 2 Th.Tip normalizirane energije sudara s fiksnim načinom energije sudara odabran je u MS/MS skeniranju ovisnom o podacima.Energija sudara postavljena na 30%.Rezolucija Orbitrap je postavljena na 15.000, a cilj AGC-a na 100%.Prilagođeno maksimalno vrijeme ubrizgavanja je postavljeno na 60 milisekundi.
Prije praćenja proteinsko-proteinske mreže u umreženim uzorcima, obrađivali smo sirove datoteke koristeći MaxQuant paket (verzija 1.6.12.0)26,27 da bismo identificirali peptide/proteine ​​koji se mogu pratiti u uzorcima.Osim toga, slične proteomske analize su obavljene na nepovezanim uzorcima Flo-1 tretiranim i netretiranim IFNα.MS/MS podaci su pretraživani u UniProt bazi podataka ljudi (www.uniprot.org) (otpremljeno 12. avgusta 2020., sadrži 75.093 unosa) pomoću ugrađenog pretraživača Andromeda27.Pretraga je izvršena bez navođenja specifičnosti enzima i raznih modifikacija deamidacije (N, Q) i oksidacije (M).Tolerancije mase prekursora su postavljene na 20 ppm, a joni proizvoda na 0,02 Da.Početno i maksimalno odstupanje mase postavljeno je na 10 ppm.Maksimalna masa peptida je postavljena na 4600 Da, a sličnost sekvence je postavljena između 7 i 25 aminokiselina (aa).Dalja statistička analiza izvršena je pomoću programa Perseus (verzija 1.6.10.45).Sadržaj proteina je izračunat normalizacijom spektralnog intenziteta proteina (LFQ intenzitet; neobilježena kvantifikacija)27 i vrijednosti intenziteta su pretvorene u Log2.Hijerarhijsko grupisanje proteina identifikovanih po intenzitetu peptida napravljeno je korišćenjem paketa pheatmap (v1.0.12) u R (v 4.1.2).Analiza obogaćivanja puteva izvedena je korištenjem Reactome baze podataka puteva za proteine ​​tretirane IFNα koji su bili više od četiri puta aktivirani u poređenju sa netretiranim uzorcima.
Identifikacija lizin (K) ili serin (S) specifičnih hemijskih unakrsnih veza proteinskih kompleksa praćenih LC-MS/MS je izvršena pomoću mašine za spektroskopsku identifikaciju (SIM-XL) za umrežene peptide (SIM-XL)29.Prvo, moguće interakcije između interferonskih (IFN) gena otpornosti na oštećenje DNK (IRDS) su istražene korištenjem skupa podataka IRDS proteina opisanog u Padariya et al.28.Provjera svih stanja i ponavljanja cjelokupnog ljudskog UniProt-a je kompjuterski intenzivna, tako da je cjelokupna ljudska UniProt baza podataka (www.uniprot.org) (preuzeta 12. avgusta 2020. sadrži 75.093 unosa) u odnosu na ponavljanja tretirana IFNα.Jedan od filtera za interakcije visokog povjerenja.Ove dobijene interakcije visokog značaja su proširene i testirane u svim ponavljanjima i uslovima.
U SIM-XL, DSS je korišćen za umrežavanje (XL), a XL pomeranje težine i pomeranje težine modifikacije su postavljeni na 138,06 odnosno 156,07.Razmatraju se sljedeća mjesta reakcije umrežavanja: KK, KS i KN-TERM, bez reporterskih jona.I prekursor i fragment ppm su postavljeni na 20, a Xrea prag je postavljen na 0,15.Smatra se da je tripsin potpuno specifičan, a primijenjena je metoda fragmentacije visokoenergetske C-zamke (HCD).XCorr dinamički prag redukcije DB i minimalni broj peptida za dinamičku redukciju DB postavljeni su na 2,5 odnosno 2.Ostali parametri su: vjerovatnoća monoizotopa i granična koincidencija pikova, minimalno 4 AA ostatka po lancu i maksimalni naboj lanca, i 3 maksimuma propuštenih podjela.Rezultirajuće spojene 2D karte su analizirane u (SIM-XL) i xQuest28 grafički prikaz je korišten za izgradnju 2D mapa.Unakrsne veze proteina na proteinskim strukturama date su u PyMolu (PyMOL Molecular Graphics System, verzija 2.0 Schrödinger, LLC).
Strukture proteinskih modela kreirane su pomoću Phyre2 servera (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 na principima homološkog modeliranja i implementacije „Skrivene Markovljeve metode“.Phyre2 generiše modelne strukture zasnovane na poravnanju sekvenci sa poznatim strukturama proteina.Za proteine ​​H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 i MDN1 korištene su šablonske strukture 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 i 6i2665.Pored toga, razmatrana je i struktura AlphaFold71 MX1, UBP18 i ROBO1.Struktura proteina je vizualizirana korištenjem BIOVIA Discovery Studio Visualizer paketa (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, Kalifornija, SAD) i paketa Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).