347 12,7*1,24 mm Namotana cijev od nehrđajućeg čelika, molekularni mehanizam sinhrone elektrostatičke kondenzacije i koagregacije α-sinukleina i tau

Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju pretraživača sa ograničenom podrškom za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Klizači koji prikazuju tri članka po slajdu.Koristite dugmad za nazad i sledeće da se krećete kroz slajdove ili dugmad kontrolora slajdova na kraju za kretanje kroz svaki slajd.

347 specifikacija cijevi od nehrđajućeg čelika

347 12.7*1.24mm Namotana cijev od nehrđajućeg čelika

Vanjski prečnik: 6,00 mm OD do 914,4 mm OD, veličine do 24” NB dostupne Ex-zaliha, OD veličina Čelične cijevi dostupne ex-lager

SS 347 Opseg debljine cijevi: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, itd. (0,5-12 mm) Ili nestandardna veličina koja se prilagođava prema potrebi

Tip: SS 347 bešavne cijevi |SS 347 ERW cijevi |SS 347 Zavarene cijevi |SS 347 Fabricated Pipes |SS 347 CDW cijevi, LSAW cijevi / šavno zavarene / ponovo nacrtane

Oblik: SS 347 okrugle cijevi/cijevi, SS 347 kvadratne cijevi/cijevi, SS 347 pravokutne cijevi/cijevi, SS 347 namotane cijevi, SS 347 “U” oblik, SS 347 zavojnice za kolače, SS 347 hidraulične cijevi

Dužina: pojedinačni slučajni, dvostruki nasumični i kraj obavezne dužine: običan kraj, zakošeni kraj, udubljeni

End Protection: Plastic Caps |Vanjska završna obrada: 2B, br.4, br.1, br.8 Ogledalo za cijevi od nehrđajućeg čelika, završna obrada prema zahtjevima kupca

Stanje isporuke: žareno i kiselo, polirano, svijetlo žareno, hladno vučeno

Inspekcija, izvještaji o ispitivanju: certifikati o ispitivanju mlina, EN 10204 3.1, kemijski izvještaji, mehanički izvještaji, izvještaji o PMI ispitivanju, izvještaji o vizuelnoj inspekciji, izvještaji o inspekciji treće strane, laboratorijski izvještaji odobreni NABL, izvještaji o destruktivnim ispitivanjima, izvještaji o nedestruktivnim ispitivanjima

Pakovanje: Pakovano u drvene kutije, plastične vrećice, čelične trake u paketu ili prema zahtjevima kupaca

Posebnosti: veličine i specifikacije koje nisu gore navedene mogu se proizvesti na zahtjev

SS 347 Raspon veličina cijevi: 1/2 inča NB, OD do 24 inča

ASTM A312 347: Bešavne i pravošavne zavarene austenitne cijevi namijenjene za visoke temperature i opću korozivnu upotrebu.Dodatni metal nije dozvoljen tokom zavarivanja.

ASTM A358 347: Austenitna cijev zavarena električnom fuzijom za korozivne i/ili visoke temperature.Obično se samo cijev do 8 inča proizvodi prema ovoj specifikaciji.Prilikom zavarivanja dozvoljeno je dodavanje dodatnog metala.

ASTM A790 347: Bešavne i ravno šavne zavarene feritno/austenitne (dupleksne) cijevi namijenjene za opću korozivnu upotrebu, s posebnim naglaskom na otpornost na pucanje od korozije pod naponom.

ASTM A409 347: električnim fuzijom zavarene austenitne cijevi velikog promjera od 14” do 30” s ravnim ili spiralnim šavom u veličinama od 14” do 30” sa zidovima Sch5S i Sch 10S za korozivne i/ili visoke

ASTM A376 347: Bešavne austenitne cijevi za primjenu na visokim temperaturama.

ASTM A813 347: Jednošavna, jednostruko ili dvostruko zavarena austenitna cijev za visoke temperature i općenito korozivne primjene.

ASTM A814 347: Hladno obrađena zavarena austenitna cijev za visoke temperature i opću korozivnu upotrebu.

347H cijevi od nehrđajućeg čelika Hemijski sastav

Mehanička svojstva cijevi od nehrđajućeg čelika 347H

Fizička svojstva cijevi od nehrđajućeg čelika 347H

Ekvivalentne ocjene za cijevi od nehrđajućeg čelika 347H

Agregacija amiloida alfa-sinukleina (αS) je znak Parkinsonove bolesti i drugih sinukleinopatija.Nedavno je tau protein koji se obično povezuje s Alchajmerovom bolešću povezan s αS patologijom i utvrđeno je da se ko-lokalizira u inkluzijama bogatim αS, iako molekularni mehanizam koagregacije ova dva proteina ostaje nejasan.Ovdje izvještavamo da se αS faza razdvaja u tekuće kondenzate putem kondenzacije elektrostatičkog kompleksa s pozitivno nabijenim polipeptidima kao što je tau.Ovisno o afinitetu αS za polikatione i stopi iscrpljivanja valencije koagulacione mreže, ugrušci se podvrgavaju brzoj gelaciji ili koalescenciji nakon čega slijedi spora agregacija amiloida.Kombinacijom niza naprednih biofizičkih tehnika, uspjeli smo okarakterizirati tečno-tečno razdvajanje αS/Tau faze i identificirati ključne faktore koji dovode do stvaranja heterogenih agregata koji sadrže oba proteina u tekućem proteinskom kondenzatu.
Osim membranskih odjeljaka, prostorno odvajanje u stanicama može se postići i formiranjem gustih tijela bogatih proteinima, nalik tekućini, koja se nazivaju biomolekularni kondenzati ili kapljice, kroz proces poznat kao razdvajanje tekućine i tekućine (LLPS).Ove kapljice nastaju multivalentnim vremenskim interakcijama, obično između proteina ili proteina i RNK, i služe za različite funkcije u gotovo svim živim sistemima.Veliki broj proteina sposobnih za LLP pokazuje sekvence niske složenosti koje su visoko neuređene u prirodi iu formiranju biomolekularnih kondenzata3,4,5.Brojne eksperimentalne studije otkrile su fleksibilnu, često neuređenu i multivalentnu prirodu proteina koji čine ove kondenzate slične tekućinama, iako se malo zna o specifičnim molekularnim determinantama koje kontroliraju rast i sazrijevanje ovih kondenzata u čvrste kondenzate. stanje..
Novi podaci podržavaju hipotezu da aberantni proteinski vođeni LLPS i transformacija kapljica u čvrste strukture mogu biti relevantni ćelijski putevi koji dovode do stvaranja netopivih toksičnih agregata koji su često obilježja degenerativnih bolesti.Mnogi intrinzično poremećeni proteini (IDP) povezani sa LLPS-om, često visoko nabijeni i fleksibilni, dugo su povezani s neurodegeneracijom kroz proces agregacije amiloida.Konkretno, pokazalo se da biomolekularni IDP kondenzati kao što su FUS7 ili TDP-438 ili proteini sa velikim domenima niske složenosti, kao što je hnRNPA19, stare u obliku gela ili čak u čvrste oblike kroz proces koji se naziva fluidizacija.spoj.u čvrstu faznu tranziciju (LSPT) kao funkciju vremena ili kao odgovor na određene posttranslacijske modifikacije ili patološki značajne mutacije1,7.
Još jedan IDP povezan s LLPS in vivo je Tau, poremećeni protein povezan s mikrotubulama čija je agregacija amiloida bila implicirana u Alchajmerovoj bolesti10, ali je također nedavno bila implicirana u Parkinsonovu bolest (PD) i druge sinaptičke nuklearne proteinopatije 11, 12, 13.Pokazalo se da se tau spontano disocira od rastvora/citoplazme zbog povoljnih elektrostatičkih interakcija14, što rezultira stvaranjem tau-obogaćenih kapljica poznatih kao elektrostatički koacervati.Također je uočeno da je ova vrsta nespecifične interakcije pokretačka snaga mnogih biomolekularnih kondenzata u prirodi15.U slučaju tau proteina, elektrostatička agregacija se može formirati jednostavnom agregacijom, u kojoj suprotno nabijene regije proteina pokreću proces cijepanja, ili složenom agregacijom kroz interakciju s negativno nabijenim polimerima kao što je RNK.
Nedavno je α-sinuklein (αS), amiloidni IDP koji je upleten u PD i druge neurodegenerativne bolesti zajedno poznate kao sinukleinopatija17,18, demonstriran na ćelijskim i životinjskim modelima19,20 koncentriran u proteinskim kondenzatima sa tečnim ponašanjem.In vitro studije su pokazale da αS prolazi kroz LLPS jednostavnom agregacijom kroz pretežno hidrofobne interakcije, iako ovaj proces zahtijeva izuzetno visoke koncentracije proteina i atipično duga vremena inkubacije19,21.Ostaje ključno neriješeno pitanje da li su kondenzati koji sadrže αS uočeni in vivo nastali ovim ili drugim LLPS procesima.Slično tome, iako je agregacija amiloida αS uočena u neuronima u PD i drugim sinukleinopatijama, tačan mehanizam kojim αS prolazi kroz intracelularnu agregaciju amiloida ostaje nejasan, jer izgleda da pretjerana ekspresija ovog proteina ne pokreće ovaj proces sama.Često je potrebno dodatno oštećenje ćelija, što sugeriše da su određene stanične lokacije ili mikrookruženja potrebne za renukleaciju intracelularnih αS amiloidnih sklopova.Jedna ćelijska sredina koja je posebno sklona agregaciji može biti unutrašnjost proteinskih kondenzata 23 .
Zanimljivo je da se αS i tau ko-lokaliziraju u karakterističnim inkluzijama bolesti kod ljudi s Parkinsonovom bolešću i drugim sinukleinopatijama 24,25, a eksperimenti su izvijestili o sinergističkoj patološkoj vezi između dva proteina 26,27 što sugerira potencijalnu vezu između agregacije αS i tau kod neurodegenerativnih bolesti.bolest.Utvrđeno je da αS i tau interaguju i promovišu međusobnu agregaciju in vitro i in vivo 28,29 i uočeni su heterogeni agregati sastavljeni od ova dva proteina u mozgu pacijenata sa sinukleinopatijama 30 .Međutim, malo se zna o molekularnoj osnovi interakcije između αS i tau i mehanizmu njegove koagregacije.Prijavljeno je da αS stupa u interakciju sa tau kroz elektrostatičku privlačnost između visoko negativno nabijenog C-terminalnog regiona αS i centralnog regiona tau bogatog prolinom, koji je također obogaćen pozitivno nabijenim ostacima.
U ovoj studiji pokazujemo da se αS zaista može disocirati u kapljice putem kondenzacije elektrostatičkog kompleksa u prisustvu tau proteina, za razliku od njegove interakcije s drugim pozitivno nabijenim polipeptidima kao što je poli-L-lizin (pLK), iu ovom procesu.αS djeluje kao skela molekule za mrežu kapljica.Identificirali smo primjetne razlike u procesu sazrijevanja elektrostatičkih αS koacervata, koje su povezane s razlikama u valentnosti i snazi ​​interakcije proteina uključenih u koacervatnu mrežu.Zanimljivo je da smo uočili koagregaciju αS i tau amiloidnih proteina u dugovječnim tekućim koacervatima i identificirali neke ključne faktore koji dovode do koagregacije ova dva proteina u takvim koacervatima.Ovdje detaljno opisujemo ovaj proces, koji je mogući molekularni mehanizam koji leži u osnovi kolokalizacije dva proteina u inkluzijama specifičnim za bolest.
αS ima visoko anjonski C-terminalni rep pri neutralnom pH (slika 1a), a mi smo pretpostavili da bi mogao proći kroz LLPS kroz kondenzaciju elektrostatičkih kompleksa sa polikationski neuređenim polipeptidnim molekulima.Koristili smo poli-L-lizin sa 100 ostataka (pLK) kao početni model molekule zbog njegove pozitivno nabijene i neuređene polimerne prirode pri neutralnom pH 32. Prvo smo potvrdili da pLK interagira sa Ct domenom αS putem NMR spektroskopije u otopini. (Slika 1b) korišćenjem αS obeleženog 13C/15N u prisustvu rastućih molarnih odnosa αS:pLK.Interakcija pLK sa Ct-domenom αS manifestuje se u perturbacijama hemijskog pomaka i smanjenju vršnog intenziteta u ovoj oblasti proteina.Zanimljivo, kada smo pomiješali αS sa pLK u koncentraciji αS od cca.5-25 µM u prisustvu polietilen glikola (5-15% PEG-8) (tipični LLPS pufer: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) odmah smo prošli kroz široko polje formiranja proteina .kapljice su uočene pomoću fluorescentne (WF) i svijetlog polja (BF) mikroskopije (slika 1c).Kapljice veličine 1-5 µm koje sadrže koncentrirani αS (dodati 1 µM AlexaFluor488-označenog αS, AF488-αS), njihova elektrostatička svojstva mogu se izvesti iz njihove otpornosti na 10% 1,6-heksandiola (1,6-HD) i njegove osjetljivosti na povećanje koncentracije NaCl (slika 1c).Priroda koacervata αS/pLK elektrostatičkog kompleksa nalik na tečnost je prikazana njihovom sposobnošću da se stapaju u roku od milisekundi (slika 1d).Koristeći turbidimetriju, kvantifikovali smo formiranje kapljica u ovim uslovima, potvrdili elektrostatičku prirodu glavne interakcije povezane sa njenom stabilnošću (slika 1e) i procenili uticaj različitih odnosa polimera na LLPS proces (slika 1f).Iako se formiranje kapljica opaža u širokom rasponu omjera polimera, proces je vrlo povoljan kada je pLK veći od αS.LLP-ovi su također primijećeni korištenjem kemijski različitog sredstva za istiskivanje dekstran-70 (70 kDa) ili korištenjem različitih formata uzoraka, uključujući kapljice staklenih pločica, mikroploče od različitih materijala, Eppendorf ili kvarcne kapilare.
a Šematski prikaz različitih proteinskih regiona u varijantama WT-αS i ΔCt-αS korištenim u ovoj studiji.Amfipatski N-terminalni domen, region koji formira hidrofobni amiloid (NAC) i negativno nabijeni C-terminalni domen prikazani su plavom, narandžastom i crvenom bojom.Prikazana je mapa Neto Charge Per Residual (NCPR) za WT-αS.b NMR analiza αS/pLK interakcije u odsustvu makromolekularnih nakupina.Kako koncentracija pLK raste (αS:pLK molarni omjeri od 1:0,5, 1:1,5 i 1:10 prikazani su svijetlozelenom, zelenom i tamnozelenom bojom).c Koacervatirati αS/pLK (molarni omjer 1:10) na 25 µM (1 µM αS-obilježen AF488 ili Atto647N-obilježen pLK za WF snimanje) u LLPS puferu (gore) ili dopunjen sa 500 mM NaCl (dolje lijevo) ili poslije10 % 1,6-heksandiol (1,6-HD; dolje desno).Skala bar = 20 µm.d Reprezentativne mikroskopske slike fuzije BF kapljica αS/pLK (molarni odnos 1:10) pri koncentraciji od 25 μM;strelice označavaju spajanje pojedinačnih kapi (crvena i žuta strelica) u novu kap (narandžasta strelica) unutar 200 ms) .Skala bar = 20 µm.e Agregacija αS/pLK raspršivanjem svjetlosti (na 350 nm) u LLPS puferu prije i poslije dodavanja 500 mM NaCl ili 10% 1,6-HD na 25 µM αS (N = 3 ponavljanja uzorka, srednja vrijednost i standardna devijacija također su naznačene).f BF slika (gore) i analiza raspršenja svjetlosti (na 350 nm, dolje) agregacije αS/pLK pri 25 μM αS sa povećanjem molarnog omjera αS:pLK (N = 3 replika uzorka, srednja vrijednost i standardna devijacija također su naznačene).Skala bar = 10 µm.Linija razmjera na jednoj slici označava skalu svih slika na jednom panelu.Neobrađeni podaci se pružaju u obliku datoteka sirovih podataka.
Na osnovu naših zapažanja kondenzacije elektrostatičkog kompleksa αS/pLK i prethodnih zapažanja αS kao klijentskog molekula kondenzata tau/RNA kroz direktnu interakciju sa tau31, pretpostavili smo da bi αS i tau mogli ko-segregirati s rastvaračem u odsustvu RNK kondenzacije.kroz elektrostatičke komplekse, a αS je protein skele u αS/Tau koacervatima (vidi distribuciju tau naboja na slici 2e).Primetili smo da kada su 10 μM αS i 10 μM Tau441 (koji sadrže 1 μM AF488-αS i 1 μM Atto647N-Tau, respektivno) pomešani zajedno u LLPS puferu, oni lako formiraju proteinske agregate koji sadrže oba proteina, kao što se vidi WF mikroskopijom.(Sl. 2a).Kolokalizacija dva proteina u kapljicama potvrđena je konfokalnom (CF) mikroskopijom (dopunska slika 1a).Slično ponašanje je uočeno kada je dekstran-70 korišten kao agens za agregaciju (dopunska slika 1c).Koristeći ili FITC-obilježeni PEG ili dekstran, otkrili smo da su oba agensa gužve bila ravnomjerno raspoređena po uzorcima, ne pokazujući ni segregaciju ni povezanost (dopunska slika 1d).Umjesto toga, to sugerira da u ovom sistemu promovišu razdvajanje faza kroz efekte makromolekularne gužve, budući da je PEG prvenstveno stabilan agens gužve, kao što se vidi u drugim LLP sistemima33,34.Ove kapljice bogate proteinima bile su osjetljive na NaCl (1 M), ali ne i na 1,6-HD (10% v/v), što potvrđuje njihova elektrostatička svojstva (dodatna slika 2a, b).Njihovo tečno ponašanje potvrđeno je posmatranjem događaja spajanja kapljica u milisekundi uz pomoć BF mikroskopije (slika 2b).
a Konfokalne (CF) mikroskopske slike αS/Tau441 koacervata u LLPS puferu (10 μM svakog proteina, 0,5 μM αS označenog AF488 i Tau441 označenog Atto647N).b Reprezentativne slike kontrasta diferencijalne interferencije (DIC) događaja fuzije αS/Tau441 kapljica (10 μM za svaki protein).c Fazni dijagram zasnovan na rasejanju svetlosti (na 350 nm) Tau441 LLPS (0–15 µM) u odsustvu (levo) ili prisustvu (desno) 50 µM αS.Toplije boje ukazuju na veće rasipanje.d Rasipanje svetlosti αS/Tau441 LLPS uzoraka sa povećanjem koncentracije αS (Tau441 na 5 µM, N = 2–3 ponavljanja uzorka kao što je naznačeno).e Šematski prikaz nekih varijanti tau proteina i različitih regiona proteina korištenih u ovoj studiji: negativno nabijena N-terminalna domena (crvena), regija bogata prolinom (plava), domena za vezivanje mikrotubula (MTBD, istaknuta narandžastom bojom) i spirala para koja formira amiloid.regije filamenta (PHF) koje se nalaze unutar MTBD (sivo).Prikazana je mapa Neto Charge Per Residue (NCPR) za Tau441.f Korištenje 1 µM αS označenog AF488 i ΔNt- označenog Atto647N, korištenjem 1 µM αS označenog AF488 ili ΔCt-αS u prisustvu ΔNt-Tau (gore, 10 µM po proteinu) ili K15 µM proteina ) ) ) mikrofotografije WF kondenzovane u LLPS ili K18 puferu.Skalirane trake na jednoj slici predstavljaju skalu svih slika na jednom panelu (20 µm za panele a, b i f).Neobrađeni podaci za panele c i d daju se kao datoteke sirovih podataka.
Da bismo testirali ulogu αS u ovom LLPS procesu, prvo smo istražili učinak αS na stabilnost kapljica nefelometrijom koristeći rastuće koncentracije NaCl (slika 2c).Što je veća koncentracija soli u uzorcima koji sadrže αS, to su veće vrijednosti raspršenja svjetlosti (na 350 nm), što ukazuje na stabilizirajuću ulogu αS u ovom LLPS sistemu.Sličan efekat se može uočiti povećanjem koncentracije αS (a time i omjera αS:Tau441) na pribl.Povećanje od 10 puta u odnosu na koncentraciju tau (5 µM) (slika 2d).Da bismo pokazali da je αS protein skele u koacervatima, odlučili smo da istražimo ponašanje LLPS-poremećenog Tau mutanta, kojem nedostaje negativno nabijena N-terminalna regija (ostaci 1-150, vidi sliku 2e) nazvana ΔNt-Tau.WF mikroskopija i nefelometrija potvrdili su da sam ΔNt-Tau nije prošao kroz LLPS (slika 2f i dodatna slika 2d), kao što je ranije objavljeno 14. Međutim, kada je αS dodan disperzijskim otopinama ove skraćene Tau varijante, LLPS proces je bio potpuno restauriran sa gustinom kapljica bliskom gustini kapljica rastvora Tau i αS pune veličine pod sličnim uslovima i koncentracijama proteina.Ovaj proces se takođe može posmatrati u uslovima niske makromolekularne gužve (dopunska slika 2c).Uloga C-terminalnog αS regiona, ali ne cele njegove dužine, u LLPS procesu je demonstrirana inhibicijom formiranja kapljica korišćenjem skraćene αS varijante C-terminala kojoj nedostaju ostaci 104–140 (Slika 1a) (ΔCt- αS) protein (slika 2f i dodatna slika 2d).Kolokalizacija αS i ΔNt-Tau potvrđena je konfokalnom fluorescentnom mikroskopijom (dopunska slika 1b).
Da bi se dalje testirao LLPS mehanizam između Tau441 i αS, korištena je dodatna Tau varijanta, odnosno fragment uparene spiralne filamentne jezgre (PHF) u domeni za vezivanje mikrotubula (MTBD), koja ako sadrži četiri karakteristična ponavljajuća domena, također poznata kao fragment K18 (vidi sl. 2e).Nedavno je objavljeno da se αS prvenstveno vezuje za tau protein koji se nalazi u domenu bogatom prolinom u sekvenci koja prethodi domenu za vezivanje mikrotubula.Međutim, PHF regija je također bogata pozitivno nabijenim ostacima (vidi sliku 2e), posebno lizinom (15% ostataka), što nas je potaknulo da testiramo da li ova regija također doprinosi kondenzaciji αS/Tau kompleksa.Primetili smo da K18 sam ne može da izazove LLPS u koncentracijama do 100 μM u testiranim uslovima (LLPS pufer sa 15% PEG ili 20% dekstrana) (Slika 2f).Međutim, kada smo dodali 50 µM αS na 50 µM K18, brzo je formiranje proteinskih kapljica koje sadrže K18 i αS uočeno nefelometrijom (dopunska slika 2d) i WF mikroskopijom (slika 2f).Kao što se očekivalo, ΔCt-αS nije bio u stanju da obnovi LLPS ponašanje K18 (slika 2f).Napominjemo da agregacija αS/K18 zahtijeva nešto veće koncentracije proteina za indukciju LLPS u poređenju sa αS/ΔNt-Tau ili αS/Tau441, pod uslovom da su ostale jednake.Ovo je u skladu sa jačom interakcijom αS C-terminalnog regiona sa Tau domenom bogatim prolinom u poređenju sa domenom koji se vezuje za mikrotubule, kao što je prethodno opisano 31 .
S obzirom da ΔNt-Tau ne može izvesti LLPS u odsustvu αS, odabrali smo ovu Tau varijantu kao model za karakterizaciju αS/Tau LLPS s obzirom na njegovu jednostavnost u LLPS sistemima sa Tau pune dužine (izotip, Tau441/Tau441).sa složenim (heterotipskim, αS/Tau441) procesima agregacije.Usporedili smo stepen agregacije αS (kao dio proteina kondenzirane faze, fαS,c) u αS/Tau i αS/ΔNt-Tau sistemima centrifugiranjem i SDS-PAGE analizom dispergirane faze (vidi 2e), pronašli smo vrlo slične vrijednosti za sve proteine ​​u istoj koncentraciji.Konkretno, dobili smo fαS,c 84 ± 2% i 79 ± 7% za αS/Tau i αS/ΔNt-Tau, respektivno, sugerirajući da je heterotipska interakcija između αS i tau superiornija od interakcije između tau molekula.između.
Interakcija sa različitim polikationima i uticaj procesa kondenzacije na kinetiku αS prvo su proučavani metodom fluorescencije nakon fotoizbeljivanja (FRAP).Testirali smo αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau i αS/pLK koacervate (100 μM αS dopunjen sa 2 μM αS AF488-αS i 100 μM Tau441 ili ΔNt-Tau ili 1 mM pLK).Podaci su dobijeni u prvih 30 minuta nakon miješanja komponenti uzorka.Iz reprezentativnih FRAP slika (slika 3a, kondenzacija αS/Tau441) i njihovih odgovarajućih krivulja vremenskog tijeka (slika 3b, dodatna slika 3), može se vidjeti da je kinetika αS vrlo slična onoj kod koacervata Tau441.i ΔNt-Tau, što je mnogo brže sa pLK.Izračunati koeficijenti difuzije za αS unutar koacervata prema FRAP-u (kao što su opisali Kang et al. 35) su D = 0,013 ± 0,009 µm2/s i D = 0,026 ± 0,008 µm2/s za αS/Tau-Sα4/Δ αS/ sistem.pLK, Tau i D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, respektivno (slika 3c).Međutim, koeficijent difuzije αS u dispergovanoj fazi je nekoliko redova veličine veći od svih kondenzovanih faza, što je određeno fluorescentnom korelacionom spektroskopijom (FCS, vidi dodatnu sliku 3) pod istim uslovima (LLPS pufer), ali u odsustvu polikationa (D = 8 ± 4 µm2/s).Zbog toga je kinetika translacije αS značajno smanjena u koacervatima u odnosu na proteine ​​u dispergovanoj fazi zbog izraženih efekata molekularne gužve, iako svi koacervati zadržavaju svojstva slična tekućini tokom prvih pola sata nakon formiranja, za razliku od tau faze.brža kinetika u pLK kondenzatu.
a–c FRAP analiza dinamike αS (2% AF488-označenog αS) u elektrostatičkim koacervatima.Reprezentativne slike αS/Tau441 FRAP testova u tri primjerka prikazane su u (a), gdje crveni krugovi označavaju obezbojena područja.Linija skale je 5 µm.b Prosječne FRAP krive i (c) izračunati koeficijenti difuzije (D) za 5-6 (N) različitih kapljica iz tri eksperimenta koristeći 100 µM αS i ekvimolarne koncentracije Tau441 (crveno) ili ΔNt-Tau (plavo) ili pLK (zeleno) u deset puta većoj koncentraciji od LLPS.Standardna devijacija FRAP krive je prikazana zasjenjenom bojom.Za usporedbu, koeficijent difuzije αS u dispergiranoj fazi određen je u tri primjerka korištenjem fluorescentne korelacijske spektroskopije (FCS) (pogledajte dodatnu sliku 3 i metode za više informacija).d Kontinuirani X-band EPR spektri 100 μM TEMPOL-122-αS u LLPS puferu bez ikakve polikacije (crno) ili u prisustvu 100 μM Tau441 (crveno) ili ΔNt-Tau (plavo) ili 1 mM pLK (zeleno).Umetak prikazuje uvećani prikaz jakih linija polja gdje se dešavaju najdramatičnije promjene.e Krive vezivanja 50 μM TEMPOL-122-αS sa različitim polikationima u odsustvu LLPS (bez PEG).Pokazano je da smanjena amplituda pojasa III u poređenju sa pojasom II (IIII/III) normalizovanog EPR spektra povećava molarne omjere Tau441 (crveno), ΔNt-Tau (plavo) i pLK (zeleno).Obojene linije pokazuju usklađenost sa podacima koristeći grubi model vezivanja sa n identičnih i nezavisnih mesta vezivanja na svakoj krivulji.Sirovi podaci se pružaju u obliku datoteka sirovih podataka.
Kao dopunu, istražili smo dinamiku αS u različitim koacervatima koristeći usmjereno spin obilježavanje (SDSL) i kontinuiranu elektronsku paramagnetnu rezonancu (CW-EPR).Ovaj metod se pokazao veoma korisnim u izveštavanju o fleksibilnosti i dinamici IRL sa realnom rezidualnom rezolucijom36,37,38.U tu svrhu, konstruisali smo cisteinske ostatke u pojedinačnim Cys mutantima i koristili spin sondu 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksil (TEMPOL).Derivati ​​maleimida ih označavaju.Tačnije, TEMPOL sonde smo ubacili na poziciju 122 ili 24 αS (TEMPOL-122-αS i TEMPOL-24-αS).U prvom slučaju ciljamo na C-terminalnu regiju proteina, koja je uključena u interakciju s polikationima.Umjesto toga, pozicija 24 nam može dati informacije o ukupnoj dinamici proteina u kondenzatu.U oba slučaja, EPR signali dobijeni za proteine ​​dispergirane faze odgovarali su nitroksidnim radikalima u brzom pokretu.Nakon razdvajanja faza u prisustvu tau ili pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ili ΔNt-Tau u omjeru 1:1 ili pLK u omjeru od 1:10), uočeno je povećanje relativnog vršnog intenziteta u EPR spektar αS.Linija gubitka se proširila, što ukazuje na smanjenu kinetiku preorijentacije αS u kapljicama u poređenju s proteinom u razrijeđenoj fazi (slika 3d, dodatna slika 4a).Ove promjene su izraženije na poziciji 122. Dok na poziciji 24 prisustvo pLK nije utjecalo na kinetiku sonde, na poziciji 122 oblik spektralne linije se značajno promijenio (dopunska slika 4a).Kada smo pokušali da modeliramo spektre na poziciji 122 dva sistema αS/polikation koristeći izotropni model (dopunska slika 5a) koji se obično koristi za opisivanje dinamike spin-obilježenog IDP38,39, nismo uspjeli rekonstruirati eksperimentalne spektre..Spektralna simulacija položaja kontrasta 24 spina (dopunska slika 5a).Ovo sugerira da postoje preferencijalne pozicije u prostoru spin konfiguracija C-terminalnog područja αS u prisustvu polikationa.Kada se uzme u obzir udio αS u kondenziranoj fazi pod eksperimentalnim EPR uvjetima (84 ± 2%, 79 ± 7% i 47 ± 4% za αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, odnosno αS/pLK - vidi Dodatni Slika 2e analize podataka c), može se vidjeti da proširenje detektovano EPR metodom uglavnom odražava interakciju C-terminalnog područja αS sa različitim polikationima u kondenziranoj fazi (glavna promjena kada se koristi TEMPOL-122- αS), a ne kondenzacija proteina.Uočeno je povećanje mikroviskoznosti u sondi.Kao što se i očekivalo, EPR spektar proteina u drugim uslovima od LLPS-a je potpuno obnovljen kada je 1 M NaCl dodan u smešu (dodatna slika 4b).Sve u svemu, naši podaci sugeriraju da promjene otkrivene CW-EPR uglavnom odražavaju interakciju C-terminalnog područja αS sa različitim polikationima u kondenziranoj fazi, a čini se da je ova interakcija jača sa pLK nego sa Tau.
Da bismo dobili više strukturnih informacija o proteinima u koacervatu, odlučili smo da proučavamo LLPS sistem korišćenjem NMR u rastvoru.Međutim, mogli smo otkriti samo αS frakciju koja je ostala u dispergiranoj fazi, što može biti posljedica smanjene dinamike proteina unutar koacervata i guste faze na dnu otopine u NMR analizi.Kada smo analizirali strukturu i dinamiku proteina koji je ostao u dispergovanoj fazi uzorka LLPS pomoću NMR (dodatna slika 5c, d), primijetili smo da se protein ponaša gotovo identično u prisustvu pLK i ΔNt-Tau, oba koji su bili u sekundarnoj strukturi i dinamici proteinske kičme, otkriveno eksperimentima na sekundarnom hemijskom pomaku i relaksaciji R1ρ.NMR podaci pokazuju da C-terminus αS trpi značajan gubitak konformacijske fleksibilnosti dok zadržava svoju neuređenu prirodu, kao i ostatak proteinske sekvence, zbog interakcije sa polikationima.
Budući da proširenje CW-EPR signala uočeno u kondenziranoj fazi TEMPOL-122-αS odražava interakciju proteina s polikationima, izvršili smo EPR titraciju kako bismo procijenili afinitet vezivanja αS na različite polikatione u odsustvu LLPS (bez akumulacije Pufer LLPS), što sugerira da su interakcije iste u razrijeđenim i koncentriranim fazama (što potvrđuju naši podaci, Dodatna slika 4a i Dodatna slika 6).Cilj je bio vidjeti da li svi koacervati, uprkos njihovim zajedničkim svojstvima sličnim tekućini, pokazuju bilo kakvo osnovno diferencijalno ponašanje na molekularnom nivou.Kao što se očekivalo, EPR spektar se proširio s povećanjem koncentracije polikationa, što odražava smanjenje molekularne fleksibilnosti zbog molekularnih interakcija svih partnera u interakciji gotovo do zasićenja (Slika 3e, Dodatna slika 6).pLK je postigao ovu zasićenost pri nižem molarnom omjeru (polikacija:αS) u poređenju sa ΔNt-Tau i Tau441.Zapravo, poređenje podataka sa približnim modelom vezivanja uz pretpostavku n identičnih i nezavisnih mjesta vezivanja pokazalo je da je prividna konstanta disocijacije pLK (~5 μM) za red veličine niža od one Tau441 ili ΔNt-Tau (~50 μM). ).µM).Iako je ovo gruba procjena, ovo sugerira da αS ima veći afinitet za jednostavnije polikacije s kontinuiranim pozitivnim naelektrisanim područjima.S obzirom na ovu razliku u afinitetu između αS i različitih polikationa, pretpostavili smo da se njihova svojstva tekućine mogu različito mijenjati tokom vremena i stoga patiti od različitih LSPT procesa.
S obzirom na veliku gužvu unutar proteinskog koacervata i amiloidnu prirodu proteina, promatrali smo ponašanje koacervata tokom vremena kako bismo otkrili moguće LSPT procese.Koristeći BF i CF mikroskopiju (slika 4), uočili smo da αS/Tau441 koacervira u velikoj mjeri u otopini, formirajući velike kapljice koje dodiruju i vlaže površinu na dnu jažice/klizača kao pune kapljice, kako se očekivalo (dodatna slika 7d);ove strukture formirane dna nazivamo "proteinskim splavovima".Ove strukture su ostale fluidne jer su zadržale sposobnost spajanja (dopunska slika 7b) i mogle su se vidjeti nekoliko sati nakon što je LLPS aktiviran (slika 4 i dopunska slika 7c).Primijetili smo da je proces vlaženja favoriziran na površini hidrofilnih, a ne hidrofobnih materijala (dopunska slika 7a), kao što se i očekivalo za elektrostatičke koacervate s neuravnoteženim nabojima i time visokim elektrostatičkim površinskim potencijalima.Značajno je da su αS/ΔNt-Tau koalescencija i rafting značajno smanjeni, dok su αS/pLK kondenzati značajno smanjeni (slika 4).Tokom kratkog vremena inkubacije, αS/pLK kapljice su se mogle spojiti i navlažiti hidrofilnu površinu, ali je ovaj proces brzo zaustavljen i nakon 5 sati inkubacije, uočeni su samo ograničeni događaji koalescencije i nikakvo vlaženje.– prelaz gel-drip.
Reprezentativni BF (ploče u nijansama sive) i CF (desni paneli, αS označen AF488 zelenom bojom) uzoraka koacervata koji sadrže 100 µM αS (1% fluorescentne oznake) u LLPS puferu u prisustvu 100 µM Tau441 (gore) mikroskopske slike N fluorescencije -Tau (centar) ili 1 mM pLK (dno) u različitim vremenima inkubacije i fokusnim visinama (z, udaljenost od dna jažice ploče).Eksperimenti su ponovljeni 4-6 puta nezavisno jedan od drugog sa istim rezultatima.Koacervati αS/Tau441 se navlaže nakon 24 sata, formirajući splavove veće od slike.Skala za sve slike je 20 µm.
Zatim smo pitali da li bi velike grupe proteina nalik tečnosti formirane u αS/Tau441 LLPS dovele do agregacije amiloida bilo kojeg od proučavanih proteina.Pratili smo sazrijevanje kapljica αS/Tau441 tokom vremena pomoću WF mikroskopije pod istim uslovima kao gore, ali koristeći 1 μM AF488-obilježen αS i Atto647N-obilježen Tau441 (slika 5a).Kao što se i očekivalo, uočili smo potpunu lokalizaciju proteina tokom procesa sazrijevanja.Zanimljivo, od ca.Nakon 5 sati uočene su intenzivnije nekružne strukture unutar splavova, koje smo nazvali „tačke“, od kojih su neke bile kolokalizirane sa αS, a neke obogaćene Tau441 (Sl. 5a, bijele strelice).Ove tačke su uvek primećene unutar splavova u većoj meri za αS/ΔNt-Tau nego za αS/ΔNt-Tau.Nije bilo posebnih tačaka u kapljicama pLK i Tau sistema nesposobnih za fuziju/kvašenje.Da bismo testirali jesu li ove mrlje koje sadrže αS i Tau441 agregati nalik amiloidu, izveli smo sličan eksperiment koristeći CF mikroskopiju u kojoj je Tau441 označen s Atto647N i 12,5 μM tioflavin-T (ThT) specifičnog za amiloid dodan je od početka.dye.Iako ThT-bojenje kapljica ili splavova αS/Tau441 nije primijećeno čak ni nakon 24 h inkubacije (slika 5b, gornji red - preostale kapljice preko proteinskih splavova), ThT-pozitivne strukture koje sadrže Atto647N-Tau441 unutar splava bile su vrlo slabe.ovo replicira veličinu, oblik i lokaciju prethodno opisanih mrlja (slika 5b, srednji i donji redovi), sugerirajući da mrlje mogu odgovarati agregatima sličnim amiloidu formiranim u koacervatima tekućine starenja.
WF 25 μM αS u različitim vremenima inkubacije i žarišnim visinama (z, udaljenost od nevezanog dna) u prisustvu 25 μM Tau441 (1 μM αS označenog AF488 i Tau441 označenog Atto647N) u jažici mikroskopske ploče s LLPS puferom) .Šest eksperimenata je nezavisno ponovljeno sa sličnim rezultatima.b CF mikroskopska slika od 25 μM αS u prisustvu 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-označenog Tau441) i 12,5 μM tioflavina-T (ThT).Ponderisane proteinske kapljice i deponovane proteinske splavove i tačke prikazane su u gornjem i srednjem redu, respektivno.Donji red prikazuje slike splavova i padova iz 3 nezavisne replike.Bijele strelice označavaju TT-pozitivne tačke na oba panela.Skala za sve slike je 20 µm.
Da bismo detaljnije ispitali promjene u mreži proteina koacervata tijekom tranzicije iz tekućine u čvrstu, koristili smo fluorescentno snimanje životnog vijeka (FLIM) i Förster rezonantnu mikroskopiju prijenosa energije (FRET) (slika 6 i dodatne slike 8 i 9).Pretpostavili smo da koacervatno sazrijevanje sloja u kondenziraniju ili čak čvrstu agregiranu strukturu proteina dovodi do bližeg kontakta između proteina i fluorescentne sonde pričvršćene na njega, potencijalno proizvodeći efekat gašenja koji se manifestira u skraćenom vijeku trajanja sonde (τ) , kao što je prethodno opisano40.,41 ,42.Osim toga, za dvostruko označene uzorke (AF488 i Atto647N kao FRET donor i akceptor boje, respektivno), ovo smanjenje τ također može biti praćeno kondenzacijom koacervata i povećanjem efikasnosti FRET(E) tokom LSPT.Pratili smo formiranje splava i tačaka tokom vremena u uzorcima LLPS αS/Tau441 i αS/ΔNt-Tau (25 µM svakog proteina u LLPS puferu koji sadrži 1 µM AF488 označenog αS i/ili Atto647N označenog Tau441 ili ΔNt-Tau).Primijetili smo opći trend da se životni vijek fluorescencije AF488 (τ488) i Atto647N (τ647N) sondi blago smanjio kako koacervati sazrijevaju (slika 6 i dodatna slika 8c).Zanimljivo je da je ova promjena značajno pojačana za tačke unutar splavova (slika 6c), što ukazuje da je došlo do daljnje kondenzacije proteina na tačkama.U prilog tome, nije primijećena značajna promjena u životnom vijeku fluorescencije za αS/ΔNt-Tau kapljice stare 24 h (dopunska slika 8d), što sugerira da je geliranje kapljica proces koji se razlikuje od uočavanja i da nije praćen značajnom molekularnom reorganizacijom unutar koacervata.Treba napomenuti da tačke imaju različite veličine i varijabilni sadržaj u αS, posebno za sistem αS/Tau441 (dopunska slika 8e).Smanjenje životnog vijeka fluorescencije tačke je praćeno povećanjem intenziteta, posebno za Atto647N označen Tau441 (dopunska slika 8a), i većom FRET efikasnosti za oba αS/Tau441 i αS/ΔNt-Tau sisteme, što ukazuje na daljnje kondenzacije FLLPS-a. nakon aktiviranja, proteini unutar statičkog elektriciteta su se kondenzirali.U poređenju sa αS/ΔNt-Tau, primetili smo niže vrednosti τ647N i nešto veće vrednosti τ488 u αS/Tau441 tačkama, praćene nižim i nehomogenim vrednostima FRET.Moguće, ovo može biti povezano s činjenicom da je u sistemu αS/Tau441, uočeno i očekivano obilje αS u agregatima heterogenije, često substehiometrijsko u poređenju sa Tau, budući da sam Tau441 također može proći kroz LLPS i agregaciju (dopunska slika 8e) .Međutim, stepen koalescencije kapljica, formiranja splava i, što je važno, agregacije proteina unutar koacervata sličnih tečnosti je maksimalan kada su prisutni i Tau441 i αS.
a Doživotna fluorescentna mikroskopija (FLIM) slike αS/Tau441 i αS/ΔNt-Tau na 25 μM svakog proteina (1 μM AF488-obilježen αS i 1 μM Atto647N-obilježen Tau441 ili ΔNt-Tau pufer) u.Kolone prikazuju reprezentativne slike LLPS uzoraka u različitim vremenima sazrevanja (30 min, 5 h i 24 h).Crveni okvir prikazuje regiju koja sadrži αS/Tau441 mrlje.Životni vijek je prikazan kao trake u boji.Skalirana traka = 20 µm za sve slike.b Uvećana FLIM slika izabranog područja, prikazana u crvenom polju na panelu a.Životni rasponi su prikazani koristeći istu skalu boja kao na panelu a.Skala bar = 5 µm.c Histogrami koji pokazuju AF488 (vezan za αS) ili Atto647N (vezan za Tau) za različite vrste proteina (kapljice-D-, splav-R- i spekle-P) identificirane na FLIM slikama snimljenim za αS-) vremenske distribucije životnog vijeka Tau441 i αS/ΔNt-Tau uzorci koacervata (N = 17-32 ROI za D, 29-44 ROI za R i 21-51 ROI za tačke).Srednje i srednje vrijednosti su prikazane kao žuti kvadrati i crne linije unutar okvira, respektivno.Donja i gornja granica okvira predstavljaju prvi i treći kvartil, respektivno, a minimalne i maksimalne vrijednosti unutar 1,5-strukog interkvartilnog raspona (IQR) prikazane su kao brkovi.Izrazi su prikazani kao crni dijamanti.Statistička značajnost između parova distribucija određena je korištenjem t-testa dva uzorka, uz pretpostavku nejednakih varijansi.Dvostrane p-vrijednosti t-testa su prikazane zvjezdicama za svaki par upoređenih podataka (* p-vrijednost > 0,01, ** p-vrijednost > 0,001, *** p-vrijednost > 0,0001, **** p-vrijednost > 0,00001), ns Ukazuje na zanemarljivost (p-vrijednost > 0,05).Tačne p vrijednosti su date u Dodatnoj tabeli 1, a originalni podaci su predstavljeni kao datoteke sirovih podataka.
Da bismo dalje demonstrirali prirodu mrlja/agregata nalik amiloidu, tretirali smo neobojene uzorke koacervata 24 sata visokim koncentracijama (1 M) NaCl, što je rezultiralo odvajanjem agregata od proteinskih koacervata.Kada su izolovani agregati (tj. dispergovani rastvor agregata) posmatrani pomoću mikroskopije atomske sile (AFM), uočili smo pretežno sferičnu morfologiju sa pravilnom visinom od oko 15 nm, koja ima tendenciju povezivanja u uslovima visoke koncentracije soli, slično ponašanje tipičnih amiloidnih fibrila zbog jakog hidrofobnog efekta na površini (imajte na umu da fibrili obično imaju visinu od ~10 nm) (dopunska slika 10a).Zanimljivo je da kada su izolovani agregati inkubirani sa ThT u standardnom testu fluorescencije ThT, uočili smo dramatično povećanje kvantnog prinosa fluorescencije ThT, uporedivo sa onim uočenim kada je boja inkubirana sa tipičnim αS amiloidnim fibrilima (dodatna slika, što sugeriše da je slika 10b). koacervatni agregati sadrže strukture slične amiloidu..Zapravo, agregati su bili tolerantni na visoke koncentracije soli, ali osjetljivi na 4 M gvanidin klorid (GdnHCl), poput tipičnih amiloidnih fibrila (dodatna slika 10c).
Zatim smo analizirali sastav agregata koristeći fluorescenciju jedne molekule, specifičnu fluorescentnu korelaciju/unakrsnu korelaciju spektroskopije (FCS/FCCS) i burst analizu detekcije dvobojnih koincidencija (TCCD).U tu svrhu, izolovali smo agregate formirane nakon 24 sata inkubacije u 100 μl LLPS uzoraka koji sadrže αS i Tau441 (oba 25 μM) zajedno sa 1 μM AF488-obilježenim αS i 1 μM Atto647N-obilježenim Tau441.Razrijedite rezultirajuću otopinu raspršenog agregata do monomolekularnog stanja koristeći isti pufer bez PEG-a i 1 M NaCl (isti pufer koji se koristi za odvajanje agregata od koacervata) kako biste spriječili sve moguće elektrostatičke interakcije između LLPS-a i proteina.Primjer vremenske putanje jednog molekula može se vidjeti na slici 7a.FCCS/FCS analiza (unakrsna korelacija, CC i autokorelacija, AC) pokazala je da su agregati koji sadrže αS i tau bili u izobilju u uzorcima (vidi CC krivulju na slici 7b, lijevi panel), a višak rezidualnog monomernog proteina nastao je kao rezultat procesa razblaživanja (vidi AC krive na slici 7b, lijevi panel).Kontrolni eksperimenti izvedeni pod istim uslovima rastvora sa uzorcima koji sadrže samo monomerne proteine ​​nisu pokazali CC krivulje, a AC krive se dobro uklapaju u jednokomponentni model difuzije (jednad. 4), gde monomerni proteini imaju očekivane koeficijente difuzije (slika 7b ), desni panel).Koeficijent difuzije agregiranih čestica je manji od 1 µm2/s, a monomernih proteina oko 1 µm2/s.50–100 µm/s;vrijednosti su slične prethodno objavljenim vrijednostima za sonicirane αS amiloidne fibrile i monomerni αS odvojeno pod sličnim uvjetima rješenja44.Kada smo analizirali agregate TCCD analizom eksplozije (slika 7c, gornji panel), otkrili smo da je u svakom izolovanom agregatu (αS/Tau heteroagregat) oko 60% otkrivenih agregata sadržavalo i αS i tau, a oko 30% samo tau, oko 10% samo αS.Stehiometrijska analiza αS/Tau heteroagregata pokazala je da je većina heteroagregata obogaćena tau (stehiometrija ispod 0,5, prosječan broj tau molekula po agregatu je 4 puta veći od αS molekula), što je u skladu s našim radom uočenim u FLIM in situ eksperimenti..FRET analiza je pokazala da ovi agregati sadrže oba proteina, iako stvarne vrijednosti FRET u ovom slučaju nisu od velike važnosti, jer je raspodjela fluorofora u svakom agregatu bila nasumična zbog viška neobilježenog proteina korištenog u eksperimentu.Zanimljivo, kada smo izvršili istu analizu koristeći 45,46 zrelu amiloidnu agregaciju sa nedostatkom Tau varijante (vidi dodatnu sliku 11a,b), primijetili smo da iako je αS elektrostatička agregacija bila ista (dopunska slika 11c, d), sposobnost formiranja agregata unutar koacervata je drastično smanjena i FLIM je otkrio nekoliko tačaka u in situ eksperimentima, a uočene su slabe krivulje unakrsne korelacije za izolovane uzorke agregata.Međutim, za mali broj otkrivenih agregata (samo jedna desetina Tau441), primijetili smo da je svaki agregat obogaćen αS od ove Tau varijante, pri čemu je otprilike 50% otkrivenih agregata sadržavalo samo αS molekule, a αS je bio heterogen u višku. .agregati (vidi dodatnu sliku 11e), za razliku od heterogenih agregata koje generiše Tau441 (slika 6f).Rezultati ovih eksperimenata su pokazali da iako je sam αS sposoban da se akumulira sa tau unutar koacervata, nukleacija taua je povoljnija pod ovim uslovima, a rezultirajući agregati slični amiloidu mogu da deluju kao oblik αS i tau.Međutim, kada se formira jezgro bogato tau, heterotipske interakcije između αS i tau su favorizovane u agregatima u odnosu na homotipske interakcije između tau molekula;takođe posmatramo proteinske mreže u tečnim αS/tau koacervatima.
a Reprezentativni vremenski tragovi fluorescencije pojedinačnih molekula izolovanih agregata formiranih u αS/Tau441 elektrostatičkim koacervatima.Rafali koji odgovaraju koagregatima αS/Tau441 (izrazi iznad naznačenog praga) su uočeni u tri kanala detekcije (emisija AF488 i Atto647N nakon direktnog pobuđivanja, plave i crvene linije, Atto647N emisija nakon indirektne ekscitacije), FRET, ljubičasta linija).b FCS/FCCS analiza uzorka izolovanih αS/Tau441 agregata dobijenih iz LLPS-a (lijevi panel).Krive autokorelacije (AC) za AF488 i Atto647N prikazane su plavom i crvenom bojom, a krive unakrsne korelacije (CC) povezane sa agregatima koji sadrže obje boje prikazane su ljubičastom bojom.AC krive odražavaju prisustvo obilježenih monomernih i agregiranih proteinskih vrsta, dok CC krive pokazuju samo difuziju dvostruko obilježenih agregata.Ista analiza, ali pod istim uslovima rastvora kao na izolovanim mestima, uzorci koji sadrže samo monomerni αS i Tau441 prikazani su kao kontrole na desnom panelu.c Fluorescentna flash analiza pojedinačnih molekula izolovanih agregata formiranih u αS/Tau441 elektrostatičkim koacervatima.Informacije za svaki agregat pronađen u četiri različita ponavljanja (N = 152) su prikazane u odnosu na njihovu stehiometriju, S vrijednosti i FRET efikasnost (gornja ploča, traka u boji odražava pojavu).Mogu se razlikovati tri tipa agregata: -αS-samo agregati sa S~1 i FRET~0, agregati samo Tau sa S~0 i FRET~1, i heterogeni Tau/αS agregati sa srednjim S i FRET Procjene količine oba markerska proteina otkrivena u svakom heterogenom agregatu (N = 100) prikazana su na donjem panelu (skala boja odražava pojavu).Sirovi podaci se pružaju u obliku datoteka sirovih podataka.
Sazrijevanje ili starenje tekućih proteinskih kondenzata u gelaste ili čvrste strukture tokom vremena je prijavljeno da je uključeno u nekoliko fizioloških funkcija kondenzata47 kao iu bolesti, kao abnormalni proces koji prethodi agregaciji amiloida 7, 48, 49. Ovdje detaljno proučavamo razdvajanje faza i ponašanje.LSPT αS u prisustvu nasumičnih polikationa u kontrolisanom okruženju pri niskim mikromolarnim koncentracijama i fiziološki relevantnim uslovima (imajte na umu da je izračunata fiziološka koncentracija αS >1 µM50), prateći tipično termodinamički vođeno ponašanje LPS.Otkrili smo da αS, koji sadrži visoko negativno nabijenu C-terminalnu regiju pri fiziološkom pH, može formirati kapljice bogate proteinima u vodenoj otopini putem LLPS-a u prisustvu visoko kationskih poremećenih peptida kao što su pLK ili Tau kroz proces elektrostatike. kompleksna kondenzacija u prisustvu agregacijskih makromolekula.Ovaj proces može imati relevantne efekte u ćelijskom okruženju gdje αS nailazi na različite polikationske molekule povezane sa njegovom agregacijom povezanom sa bolešću i in vitro i in vivo51,52,53,54.
U mnogim studijama, dinamika proteina unutar kapljica smatrana je jednim od ključnih faktora koji određuju proces sazrijevanja55,56.U elektrostatičkim αS koacervatima s polikationima, proces sazrijevanja očigledno ovisi o jačini interakcije s polikationima, valentnosti i višestrukosti ovih interakcija.Teorija ravnoteže sugerira da bi ravnotežni krajolik dva tečna stanja bio prisustvo velike kapljice bogate biopolimerima koji pokreću LLPS57,58.Rast kapljica može se postići Ostwaldovim sazrijevanjem59, koalescencijom60 ili potrošnjom slobodnog monomera u disperznoj fazi61.Za αS i Tau441, ΔNt-Tau ili pLK, većina proteina je koncentrisana u kondenzatu pod uslovima korištenim u ovoj studiji.Međutim, dok su se tau kapljice pune veličine brzo spajale nakon površinskog vlaženja, spajanje i vlaženje kapljica su bili teški za ΔNt-Tau i pLK, što ukazuje na brz gubitak svojstava tekućine u ova dva sistema.Prema našoj FLIM-FRET analizi, ostarjele pLK i ΔNt-Tau kapljice pokazale su sličan stupanj agregacije proteina (sličan vijek trajanja fluorescencije) kao originalne kapljice, što sugerira da je originalna proteinska mreža zadržana, iako čvršća.
Naše eksperimentalne rezultate racionaliziramo u sljedećem modelu (slika 8).Prvotno privremeno formirane kapljice su često proteinske mreže bez elektrostatičke kompenzacije, pa stoga postoje područja neravnoteže naboja, posebno na sučelju kapljica, što rezultira kapljicama s visokim elektrostatičkim površinskim potencijalom.Da bi se kompenzirao naboj (fenomen koji se obično naziva smanjenjem valencije) i minimizirao površinski potencijal kapljica, kapljice mogu uključivati ​​nove polipeptide iz razrijeđene faze, reorganizirati proteinske mreže radi optimizacije interakcija naboj-naboj i interakciju s drugim kapljicama.sa površinama (kvašenje).Kapljice αS/pLK, zbog svoje jednostavnije proteinske mreže (samo heterotipske interakcije između αS i pLK) i većeg afiniteta za interakcije protein-protein, izgleda da mogu brže izbalansirati naboj kondenzata;zaista, uočili smo bržu kinetiku proteina u inicijalno formiranim αS/pLK koacervatima nego u αS/Tau.Nakon iscrpljivanja valencije, interakcije postaju manje efemerne i kapljice gube svoja tečna svojstva i pretvaraju se u gel-like, nezapaljive kapljice s niskim elektrostatičkim površinskim potencijalom (i stoga ne mogu navlažiti površinu).Nasuprot tome, αS/Tau kapljice su manje efikasne u optimizaciji balansa naboja kapljica zbog složenijih proteinskih mreža (sa homotipskim i heterotipskim interakcijama) i slabije prirode proteinskih interakcija.Ovo rezultira kapljicama koje zadržavaju tečno ponašanje tokom dužeg vremenskog perioda i pokazuju visok elektrostatički površinski potencijal koji se nastoji minimizirati spajanjem i rastom (na taj način minimizirajući omjer površine i zapremine kapljica) i vlaženjem hidrofilne površinske kemikalije.Ovo stvara velike koncentrisane biblioteke proteina koje zadržavaju svojstva fluida jer interakcije ostaju vrlo prolazne zbog stalne potrage za optimizacijom naboja u mreži proteina.Zanimljivo je da N-terminalno skraćeni oblici Taua, uključujući neke prirodne izoforme62, pokazuju srednje ponašanje, pri čemu neki koacervati stare s αS u dugovječne kapljice nalik gelu, dok se drugi pretvaraju u velike tekuće kondenzate.Ovaj dualitet u sazrevanju αS elektrostatičkih koacervata je u skladu sa nedavnim teorijskim i eksperimentalnim studijama LLPS-a koje su identifikovale korelaciju između iscrpljivanja valencije i elektrostatičkog prosijavanja u kondenzatima kao ključa za kontrolu veličine kondenzata i svojstava fluida.Mehanizam 58.61.
Ova šema prikazuje pretpostavljeni put agregacije amiloida za αS i Tau441 preko LLPS i LSPT.Uz dodatne regije bogate anjonima (crvene) i katjone (plave), αS i tau elektrostatički koacervati sa zadovoljavajućom valentnošću imaju nižu površinsku energiju i stoga manju koalescenciju, što rezultira brzim starenjem kapljica.Postiže se stabilno neaglomerirano stanje gela..Ova situacija je vrlo povoljna u slučaju αS/pLK sistema zbog njegovog većeg afiniteta i jednostavnije mreže interakcije protein-par, koja omogućava brzu tranziciju nalik gelu.Naprotiv, kapljice sa nezadovoljavajućom valentnošću i, prema tome, proteinski nabijeni regioni dostupni za interakciju, olakšavaju koacervatu da se stopi i navlaži hidrofilnu površinu kako bi se smanjila njegova visoka površinska energija.Ova situacija je poželjnija za αS/Tau441 koacervate, koji imaju multivalentnu kompleksnu mrežu koja se sastoji od slabih Tau-Tau i αS-Tau interakcija.Zauzvrat, veći koacervati će lakše zadržati svoja svojstva slična tekućini, omogućavajući drugim interakcijama protein-protein.Konačno, amiloidni heterogeni agregati koji sadrže i αS i tau formiraju se unutar koacervatne tekućine, što može biti povezano s onima koji se nalaze u inkluzijskim tijelima, koja su obilježja neurodegenerativnih bolesti.
Velike strukture nalik na fluid formirane tokom sazrevanja αS/Tau441 sa veoma zagušenim, ali dinamičnim proteinskim okruženjem i, u manjoj meri, αS/ΔNt-Tau koacervatima su idealni rezervoari za nukleaciju agregacije proteina.Zaista smo primijetili stvaranje čvrstih proteinskih agregata u ovoj vrsti proteinskih koacervata, koji često sadrže i αS i tau.Pokazali smo da su ovi heteroagregati stabilizirani neelektrostatičkim interakcijama, sposobni su da vežu amiloidne specifične ThT boje na isti način kao tipične amiloidne fibrile i zaista imaju sličnu otpornost na različite utjecaje.Pokazalo se da αS/tau agregati formirani LLPS imaju svojstva slična amiloidu.Zaista, zrela varijanta Tau sa manjkom agregacije amiloida značajno je narušena u formiranju ovih heterogenih αS agregata unutar tečnog elektrostatičkog koacervata.Formiranje αS/Tau441 agregata uočeno je samo unutar koacervata, koji su zadržali svojstva slična tekućini, i nikada, ako koacervati/kapljice nisu dospjeli u stanje gela.U potonjem slučaju, povećana snaga elektrostatičkih interakcija i, kao rezultat toga, rigidnost proteinske mreže sprečavaju neophodna konformaciona preuređivanja proteina za uspostavljanje novih interakcija proteina neophodnih za nukleaciju amiloida.Međutim, to se može postići u fleksibilnijim koacervatima sličnim tekućini, za koje je vjerojatnije da će ostati tečni kako se povećavaju.
Činjenica da je formiranje agregata unutar kondenzirane faze poželjnije u velikim αS/Tau kondenzatima nego u malim kapljicama koje se brzo geliraju, naglašava važnost identifikacije faktora koji kontroliraju koalescenciju kapljica.Dakle, ne samo da postoji tendencija razdvajanja faza, već se i veličina kondenzata mora kontrolisati radi pravilnog funkcionisanja, kao i prevencije bolesti58,61.Naši rezultati takođe naglašavaju važnost ravnoteže između LLPS i LSPT za αS/Tau sistem.Dok formiranje kapljica može zaštititi od agregacije amiloida smanjenjem količine proteinskih monomera dostupnih u uvjetima zasićenja, kao što je predloženo u drugim sistemima63,64, fuzija kapljica na visokim razinama kapljica može dovesti do unutrašnje agregacije proteina kroz spore konformacijske preraspodjele.proteinske mreže..
Sve u svemu, naši podaci snažno naglašavaju relevantnost kohezivne valencije i zadovoljnih/nezadovoljnih interakcija u mrežama pada u kontekstu LSPT.Konkretno, pokazujemo da su kondenzati αS/Tau441 pune dužine u stanju da se efikasno stapaju i stvaraju jezgru da formiraju heteroagregate slične amiloidu koji uključuju oba proteina i predlažu molekularni mehanizam zasnovan na našim eksperimentalnim rezultatima.Koagregacija dva proteina u koacervatu αS/Tau fluida o kojoj ovdje izvještavamo zaista može biti povezana sa ko-lokalizacijom dva proteina u inkluzijama, koje su obilježja bolesti, i može doprinijeti razumijevanju odnosa između LLPS-a i agregacije amiloida, otvarajući put visoko nabijenom IDP-u u neurodegeneraciji.
Monomerni WT-αS, mutanti cisteina (Q24C-αS, N122C-αS) i ΔCt-αS varijante (Δ101-140) su eksprimirani u E. coli i pročišćeni kako je prethodno opisano.5 mM DTT je uključen u sve korake u prečišćavanju αS cisteinskih mutanata kako bi se spriječilo stvaranje disulfidne veze.Tau441 izoforma (plazmid dobijen iz Addgene #16316), ΔNt-Tau varijanta (Δ1–150, dobijen kloniranjem IVA sa prajmerima CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC-Tau1CTDAC, purificirani ΔTau1CTDAC, purificirani ΔTau1CTDAC) 5 prajmera) E. coli kulture su bile narastao do OD600 = 0,6–0,7 na 37°C i 180 o/min, a ekspresija je indukovana IPTG-om 3 sata na 37°C.Sakupite ćelije na 11.500 xg tokom 15 minuta na 4 °C i isperite slanim puferom koji sadrži 150 mM NaCl.Resuspendirajte pelet u puferu za lizu (20 ml po 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, μM1 μpM0).Korak sonikacije izveden je na ledu sa amplitudom od 80% za 10 impulsa (1 min uključeno, 1 min isključeno).Ne prelazite 60 ml u jednom ultrazvuku.E. coli lizati su zagrevani na 95°C tokom 20 minuta, zatim ohlađeni na ledu i centrifugirani na 127,000×g tokom 40 minuta.Pročišćeni supernatant je nanesen na membranu od 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) i dijaliziran protiv 4 L pufera za dijalizu (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 DTT 2 , PMSF 0,1 mM) tokom 10 sati.Kolona za kationsku izmjenu od 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, SAD) uravnotežena je puferom za ravnotežu (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM DTT, 0,1)Tau lizat je filtriran kroz 0,22 μm PVDF filter i ubrizgan u kolonu brzinom protoka od 1 ml/min.Eluiranje je vršeno postepeno, tau je eluiran sa 15–30% pufera za eluiranje (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Frakcije su analizirane pomoću SDS-PAGE, a sve frakcije koje sadrže jednu traku sa očekivanom molekulskom težinom tau koncentrirane su pomoću 10 kDa centrifugalnog filtera i zamijenjene puferom koji sadrži 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM i DTT 2 mM za konačna koncentracija proteina bila je 100 μM.Proteinski rastvor je zatim propušten kroz 0,22 μm PVDF filter, brzo zamrznut i pohranjen na -80°C.Protein K18 je ljubazno obezbijedio prof. Alberto Boffi.Čistoća preparata je bila >95% što je potvrđeno SDS-PAGE i MALDI-TOF/TOF.Različiti cisteini su hemijski obeleženi AlexaFluor488-maleimidom (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAD) ili TEMPOL-maleimidom (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).su potvrđene apsorpcijom i MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau i K18 su označeni nativnim ostacima cisteina na pozicijama 191 i 322 pomoću Atto647N-maleimida (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Njemačka) po istoj proceduri.Mape neto naplate po ostatku za αS i Tau441 generirane su pomoću CIDER66.
Čvrsti poli-L-lizin (pLK DP 90-110 prema NMR od dobavljača, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, SAD) je otopljen u 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 do 10 mM za koncentraciju 5, proces ultrazvuk minuta u ultrazvučnom vodenom kupatilu i čuvati na -20°C.PEG-8, dekstran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, SAD) i FITC-dekstran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, SAD) su rastvorljivi u vodi i široko rasprostranjeni u LLPS puferu.Dijalizom se uklanjaju kontaminirajuće soli.Zatim su filtrirani kroz špric filter sa veličinom pora od 0,22 μm, a njihove koncentracije su izračunate pomoću refraktometra (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).LLPS uzorci su pripremljeni na sobnoj temperaturi sljedećim redoslijedom: pufer i ekstruzija su pomiješani i 1 mM tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(etan- 1,2-diildinitril) tetraoctenu kiselinu (EDTA, karboksint) i mješavinu 1% inhibitora proteaze (PMSF 100 mM, benzimid 1 mM, leupeptin 5 μM).Zatim se dodaju αS i fuzionisani polikationi (opcije pLK ili Tau).Za eksperimente s tioflavin-T vremenskim serijama (ThT, Carbosynth, Compton, UK), koristite ukupnu koncentraciju ThT da bude polovina koncentracije αS.Nježno, ali temeljno promiješajte uzorke kako biste bili sigurni da su homogeni.Koncentracija svake komponente varirala je od eksperimenta do eksperimenta, kao što je opisano u odjeljku Rezultati.Azid je korišćen u koncentraciji od 0,02% (w/v) kad god je trajanje eksperimenta prelazilo 4 sata.Za sve analize koje koriste LLPS uzorke, ostavite smjesu da se uravnoteži 5 minuta prije analize.Za analizu raspršenja svjetlosti, 150 µl uzoraka stavljeno je na nevezujuće mikroploče sa 96 jažica (µClear®, crne, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austrija) i prekrivene ljepljivom folijom.LLP-ovi su praćeni merenjem apsorbancije na 350 nm u centru rastvora u CLARIOstar čitaču ploča (BMG Labtech, Ortenberg, Nemačka).Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka na 25°C, a greške su izračunate kao standardna devijacija od srednje vrijednosti.Razrijeđena faza je kvantificirana centrifugiranjem uzorka i SDS-PAGE gel analizom, a αS frakcija u razrijeđenoj i koncentriranoj fazi je kvantificirana u različitim LLPS otopinama.100 μl LLPS uzorak koji sadrži 1 μM AF488-obilježenog αS pripremljen je temeljnim miješanjem nakon čega je uslijedilo centrifugiranje na 9600×g tokom 30 minuta, nakon čega je talog obično bio vidljiv.Gornjih 50 μl supernatanta korišteno je za kvantifikaciju proteina korištenjem SDS-PAGE gela.Gelovi su skenirani AF488 filterima pomoću ChemiDoc sistema za snimanje gela (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornija, SAD) ili su obojeni Coomassie bojom i vizualizirani odgovarajućim filterima.Rezultirajuće trake su analizirane pomoću ImageJ verzije 1.53i (Nacionalni institut za zdravlje, SAD).Eksperimenti su izvedeni u duplikatu u dva različita eksperimenta sa sličnim rezultatima.
Tipično, 150 μl uzoraka je naneseno na nevezujuće mikroploče sa 96 jažica i vizualizirano na sobnoj temperaturi na Leica DMI6000B invertnom mikroskopu (Leica Microsystems, Wetzlar, Njemačka).Za spot eksperimente korišćene su i µ-Slide Angiogenesis ploče (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Nemačka) ili polistirenske mikroploče sa 96 jažica (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).EL6000 halogene ili živine metal-halogene sijalice su korištene kao izvori osvjetljenja (za BF/DIC i WF snimanje, respektivno).Za WF mikroskopiju korišćen je vazdušni objektiv sa uvećanjem od 40x (Leica Microsystems, Nemačka) za fokusiranje svetlosti na uzorak i njegovo prikupljanje.Za uzorke označene sa AF488 i ThT, pobuđivanje i emisija filtera sa standardnim GFP filterima, ekscitacioni i emisioni propusni filteri, respektivno, 460–500 nm i 512–542 nm propusni filteri i 495 nm dikroično ogledalo.Za uzorke označene sa Atto647N, korišćen je standardni set Cy5 filtera sa ekscitacionim i emisionim propusnim filterima 628–40 nm i 692–40 nm, respektivno, i 660 nm dikroičnim ogledalom.Za BF i DIC mikroskopiju koristite isti objektiv za prikupljanje reflektovanog svjetla.Prikupljeno svjetlo je snimljeno Leica DFC7000 CCD kamerom (Leica Microsystems, Njemačka).Vrijeme ekspozicije je bilo 50 ms za BF i DIC mikroskopsko snimanje i 20-100 ms za WF mikroskopsko snimanje.Poređenja radi, vrijeme ekspozicije za sve eksperimente s ThT bilo je 100 ms.Time-lapse eksperimenti su izvedeni kako bi se vizualiziralo spajanje kapljica, pri čemu su slike prikupljane svakih 100 ms tokom nekoliko minuta.ImageJ (NIH, SAD) je korišten za analizu slike.Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka sa sličnim rezultatima.
Za eksperimente kolokalizacije, FRAP i 3D rekonstrukciju, slike su dobijene na Zeiss LSM 880 invertovanom konfokalnom mikroskopu korištenjem ZEN 2 plavog izdanja (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Njemačka).Uzorci od 50 µl su primijenjeni na µ-Slide Angiogenesis Petrijeve zdjelice (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Njemačka), tretirane hidrofilnim polimerom (ibiTreat) i postavljene u 63× uljni objektiv (Plan-Apochromat 63×/NA 1,4 Oil) na DIC).Slike su dobijene pomoću argon laserskih linija od 458 nm, 488 nm i 633 nm sa rezolucijom od 0,26 µm/piksel i vremenom ekspozicije od 8 µs/piksel za prozore za pobuđivanje i detekciju emisije od 470-600 nm, 493-62 nm. i 638–755 nm je korišten za vizualizaciju ThT, AF488 i Atto647N, respektivno.Za FRAP eksperimente, time-lapse fotografija svakog uzorka snimljena je pri 1 kadru u sekundi.Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka na sobnoj temperaturi sa sličnim rezultatima.Sve slike su analizirane pomoću softvera Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Njemačka).FRAP krive su normalizovane, iscrtane i prilagođene podacima o intenzitetu/vremenu ekstrahovanim iz slika korišćenjem Zen 2 koristeći OriginPro 9.1.Krivulje oporavka su prilagođene mono-eksponencijalnom modelu kako bi se uzela u obzir molekularna difuzija s dodatnim eksponencijalnim terminom koji bi uračunao efekat izbjeljivanja akvizicije.Zatim smo izračunali D koristeći nominalni radijus izbjeljivanja i prethodno utvrđeno poluvrijeme oporavka kao u jednadžbi Kang et al.5 35 prikazano.
Pojedinačne cisteinske varijante αS sintetizirane su sa 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksilom (TEMPOL) na pozicijama 24 (TEMPOL-24-αS) i 122 (TEMPOL-122-αS), respektivno.Spin Labeling Za EPR eksperimente, koncentracija αS je postavljena na 100 μM, a koncentracija PEG-a je bila 15% (w/v).Za različite uslove agregacije, odnos αS:pLK je bio 1:10, dok su omjeri αS:ΔNt-Tau i αS:Tau441 održavani na 1:1.Za eksperimente titracije vezivanja u odsustvu gužve, TEMPOL-122-αS je održavan na 50 μM, a polikationi su titrirani u rastućim koncentracijama, pripremajući svaki uslov posebno.CW-EPR mjerenja su obavljena korištenjem Bruker ELEXSYS E580 X-band spektrometra opremljenog Bruker ER4118 SPT-N1 rezonatorom koji radi na mikrovalnoj (SHF) frekvenciji od ~9,7 GHz.Temperatura je postavljena na 25°C i kontrolirana kriostatom s tekućim dušikom.Spektri su dobijeni u nezasićenim uslovima pri MW snazi ​​od 4 mW, amplitudi modulacije od 0,1 mT i frekvenciji modulacije od 100 kHz.Spektralni intenziteti su normalizirani kako bi se izbjegle razlike u koncentracijama spina između uzoraka i moguće smanjenje spina zbog rezidualnih koncentracija redukcijskih agenasa u uzorcima koji sadrže Tau441 ili ΔNt-Tau (prisutan u originalnim otopinama proteina).Zadate vrijednosti g dobijene su kao rezultat EPR spektralnog modeliranja izvedenog pomoću Easyspin softvera (v. 6.0.0-dev.34) implementiranog u Matlab®67.Jedno/dvokomponentni izotropni modeli korišteni su za modeliranje podataka.Nakon normalizacije svih signala, reziduali su izračunati oduzimanjem svake simulacije od odgovarajućeg eksperimentalnog spektra.Za analizu titracije vezivanja, relativni intenzitet trećeg i drugog pojasa normalizovanog EPR spektra (IIII/III) korišćen je za praćenje vezivanja polikationa za αS.Za procjenu konstante disocijacije (Kd), rezultirajuća kriva je prilagođena približnom modelu uz pretpostavku n identičnih i nezavisnih mjesta vezivanja.
Eksperimenti NMR spektroskopije su izvedeni korišćenjem Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spektrometra opremljenog kriosondom i Z-gradijentom.Svi eksperimenti su izvedeni korišćenjem 130–207 µM αS i odgovarajućih αS/ΔNt-Tau i pLK ekvivalenata u 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 i izvedeni su na 15°C.Za praćenje LPS pomoću NMR, 10% PEG je dodato u prethodno pomiješane uzorke.Grafikon perturbacije hemijskog pomaka (slika 1b) pokazuje prosječne 1H i 15N hemijske pomake.αS 2D1H-15N HSQC spektri su dodijeljeni na osnovu prethodnog dodjeljivanja (BMRB unos #25227) i potvrđeni snimanjem i analizom 3D spektra HNCA, HNCO i CBCAcoNH.Hemijski pomaci 13Cα i 13Cβ izračunati su u prisustvu ΔNt-Tau ili pLK kako bi se izmjerile moguće promjene u trendovima sekundarne strukture u usporedbi s αS kemijskim pomacima u čisto slučajnoj konformaciji zavojnice 68 (dodatna slika 5c).Brzine R1ρ mjerene su snimanjem eksperimenata hsqctretf3gpsi (dobijenih iz Brukerove biblioteke) s kašnjenjima od 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 i 800 ms, a eksponencijalne funkcije su prilagođene vršnim kašnjenjima intenziteta na puta za određivanje R1ρ i njegove eksperimentalne nesigurnosti.
Eksperimenti fluorescentne mikroskopije u dvije boje s vremenskim razlučivanjem izvedeni su na komercijalnom MT200 fluorescentnom konfokalnom mikroskopu s vremenskim razlučivanjem (PicoQuant, Berlin, Njemačka) sa vremenski koreliranim uređajem za brojanje pojedinačnih fotona (TCSPC).Glava laserske diode se koristi za impulsnu interleaved excitation (PIE), snop prolazi kroz jednomodni talasovod i podešava se na snagu lasera od 10 do 100 nW za laserske linije od 481 nm i 637 nm merene nakon dikroičnog ogledala.Ovo osigurava optimalnu brzinu brojanja fotona, izbjegavajući efekte fotona zamašnjavanja, fotoizbjeljivanja i zasićenja.Poklopci ili ploče za angiogenezu μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Njemačka) stavljene su direktno u imerzijsku vodu preko Super Apochromat 60x NA 1.2 sočiva s korektivnom kragnom (Olympus Life Sciences, Waltham, SAD).Kao glavni razdjelnik snopa korišteno je dihroično ogledalo od 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, SAD).Nefokusirano zračenje je blokirano rupom prečnika 50 mikrona, a zatim se fokusirano zračenje deli na 2 puta detekcije pomoću razdelnika snopa 50/50.Ispred detektora korišteni su propusni emisioni filteri (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 za zelenu boju (AF488) i 690/70 za crvenu boju (Atto647N).Kao detektori korištene su jednofotonske lavinske diode (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italija).I prikupljanje podataka i analiza obavljeni su korištenjem komercijalno dostupnog softvera SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Berlin, Njemačka).
Pedeset mikrolitara LLPS uzoraka je primijenjeno na μ-Slide angiogenezne jažice (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Njemačka).Rezultirajuće slike su fokusirane na 20 µm iznad dna bunara za optimalnu radnu udaljenost objektiva za suspendirane kapljice i na ~1 µm za splavove i tačke s aksijalnom rezolucijom od najmanje 0,25 µm/piksel i vremenom kašnjenja od 400 µs/piksel.Odaberite podatke primjenom praga intenziteta zasnovanog na prosječnom intenzitetu pozadinskog signala (PBG, srednja vrijednost + 2σ) za svaki kanal, tako da se odabiru samo kapljice tekućeg proteina, splavi ili mrlje, filtrirajući svako moguće porijeklo iz dispergirane faze.Da bismo analizirali životni vijek svake vrste (τ) svakog kanala (zeleno, "g" za AF488 i crveno, "r" za Atto647N), odabrali smo regije od interesa (ROI) koje sadrže kapljice, splavove ili mrlje (dodatna slika 1 ).8b) i izveo ih prilagođavanjem njihovog životnog raspada (τD, τR i τP za kapljice, splavove ili mrlje, respektivno, vidi dodatnu sliku 8c) u svakom kanalu koristeći analizu uklapanja repa i dvokomponentni model raspadanja.Prosjek τ od τ .ROI koji su proizveli premalo fotona za multi-eksponencijalno uklapanje isključeni su iz analize.Korišćena granica je <104 fotona za splavove i tačke i 103 za kapi.Kapljice imaju niži prag jer je teško dobiti krivulje raspada sa većim vrijednostima intenziteta, jer su kapljice u polju slike obično manje i manje brojne.ROI sa brojem fotona iznad granice akumulacije fotona (postavljeno na >500 broja/piksel) su takođe odbačeni za analizu.Uskladite krivu opadanja intenziteta dobivenu iz područja od interesa sa intenzitetom od 90% maksimuma (nešto nakon maksimalnog intenziteta opadanja) od početka radnog vijeka kako biste osigurali minimalne IRF smetnje uz zadržavanje iste za sve opadanje intenziteta postavke Relativni vremenski okvir Analizirano je 25 do 50 ROI za splavove i tačke i 15-25 ROI za kapi, slike odabrane iz više od 4 ponavljanja snimljene iz najmanje 3 nezavisna eksperimenta.Dvostrani t-testovi su korišteni za procjenu statističkih razlika između vrsta ili između koacervatnih sistema.Za piksel po piksel analizu životnog vijeka (τ), izračunato je ukupno prigušenje vijeka trajanja u polju za svaki kanal i izvršena je aproksimacija 2/3-komponentnog eksponencijalnog modela slabljenja.Prigušenje životnog vijeka za svaki piksel je zatim prilagođeno korištenjem prethodno izračunatih vrijednosti τ, što je rezultiralo pseudobojnom FLIM fit slikom.Opseg životnog vijeka uklapanja repa bio je isti na svim slikama istog kanala, a svaki raspad je proizveo dovoljno fotona da se osigura pouzdano uklapanje.Za FRET analizu, pikseli su odabrani primjenom nižeg praga intenziteta od 100 fotona, što je prosječno pozadinski signal (FBG) od 11 fotona.Intenzitet fluorescencije svakog kanala je korigovan eksperimentalno utvrđenim faktorima korekcije: 69 spektralnog preslušavanja α je bio 0,004, direktna ekscitacija β je bila 0,0305, efikasnost detekcije γ je bila 0,517.Efikasnost FRET na nivou piksela se zatim izračunava pomoću sljedeće jednačine:
gdje je FDD intenzitet fluorescencije uočen u donor (zelenom) kanalu, FDA je intenzitet fluorescencije uočen u akceptorskom (crvenom) kanalu pod indirektnom ekscitacijom, a FAA je intenzitet fluorescencije uočen u akceptorskom (crvenom) kanalu pod direktnom ekscitacijom ( PIE).U kanalu se uočavaju impulsi intenziteta fluorescencije).
Stavite 100 µl LLPS reakcionih otopina koje sadrže 25 µM neobilježenog monomernog Tau441 (sa ili bez 25 µM αS) u LLPS pufer (dopunjen kao gore) na nevezujuće mikroploče sa 96 jažica s ljepljivom folijom i mikroskopskim ispitivanjem formiranja kapljica od strane WF ekvilibracija.u roku od 10 min.Nakon 48 sati inkubacije na sobnoj temperaturi, potvrđeno je prisustvo proteinskih splavova i mrlja.Zatim pažljivo uklonite tečnost preko splavova iz jažica, zatim dodajte 50 L pufera za disocijaciju (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) i inkubirajte 10 min.Visoka koncentracija soli osigurava da se LLPS neće ponoviti zbog rezidualnog PEG-a, a mogući proteinski sklopovi formirani samo elektrostatičkim interakcijama bit će rastavljeni.Dno jažice je zatim pažljivo sastrugano vrhom mikropipete i dobijeni rastvor je prebačen u praznu jažicu za posmatranje.Nakon inkubacije uzoraka sa 50 μM ThT tokom 1 h, prisustvo izolovanih mrlja je provereno WF mikroskopijom.Pripremite ultrazvučne αS fibrile inkubiranjem 300 µl 70-µM otopine αS u PBS-u sa pH 7,4, natrijum azidom 0,01% na 37 °C i 200 rpm na orbitalnom šejkeru tokom 7 dana.Otopina je zatim centrifugirana na 9600×g 30 minuta, peleta je resuspendirana u PBS pH 7,4 i sonikirana (1 min, 50% ciklus, 80% amplituda u Vibra-Cell VC130 sonikatoru, Sonics, Newton, USA) uzorci fibrila sa relativno ujednačenom distribucijom malih fibrila.
FCS/FCCS analiza i detekcija dvobojnih koincidencija (TCCD) izvedeni su na istom MT200 vremenski razlučenom fluorescentnom konfokalnom mikroskopu (Pico-Quant, Berlin, Njemačka) korištenom za eksperimente FLIM-FRET mikroskopije koristeći PIE mod.Snaga lasera za ove eksperimente dodata je na 6,0 µW (481 nm) i 6,2 µW (637 nm).Kombinacija ovih laserskih snaga je odabrana da proizvede sličnu svjetlinu za parove korištenih fluorofora uz postizanje optimalne stope brojanja i izbjegavanje fotoizbjeljivanja i zasićenja.I prikupljanje podataka i analiza obavljeni su korištenjem komercijalno dostupnog softvera SymphoTime64 verzija 2.3 (PicoQuant, Berlin, Njemačka).
Uzorci izolovanih αS/Tau agregata dobijenih korištenjem LLPS razrijeđeni su u puferu za izolaciju do odgovarajuće monomolekularne koncentracije (obično razrjeđenje 1:500, budući da su agregati već u niskim koncentracijama kada su izolirani iz uzoraka koacervata).Uzorci su naneseni direktno na pokrovna stakla (Corning, SAD) prethodno premazana otopinom BSA u koncentraciji od 1 mg/mL.
Za PIE-smFRET analizu u zelenom i crvenom kanalu, primijenjen je niži prag intenziteta od 25 fotona da se filtriraju signali niskog intenziteta uzrokovani monomernim događajima (imajte na umu da su monomeri brojniji od agregiranih uzoraka u odnosu na izolovane agregate).Ovaj prag je izračunat kao petostruki prosječni intenzitet monomernog αS dobijenog analizom uzoraka čistog monomera kako bi se posebno odabrali agregati za analizu.PIE pogonsko kolo, zajedno sa TSCPC akvizicijom podataka, omogućilo je primjenu doživotnog težinskog filtera koji pomaže u eliminaciji pozadinskih i spektralnih preslušavanja.Intenzitet baklje odabran korištenjem gornjih pragova korigovan je korištenjem prosječnog pozadinskog signala određenog iz histograma pojavljivanja u odnosu na intenzitet/bin uzoraka samo u puferu.Rafali povezani sa velikim agregatima obično zauzimaju nekoliko uzastopnih binova u vremenskom tragu (podešeno na 1 ms).U tim slučajevima je odabrana kanta maksimalne snage.Za FRET i stehiometrijsku analizu korišten je teoretski određen gama faktor γ (0,517).Doprinosi spektralnog preslušavanja i direktnog pobuđivanja su zanemarljivi (utvrđeni eksperimentalno) pri korištenoj snazi ​​pobudnog lasera.Efikasnost i stehiometrija FRET-a u eksploziji se izračunava na sljedeći način.