310 10*1mm Hemijska komponenta zavojne cijevi od nehrđajućeg čelika, N-terminalni domeni spidroina formiraju hidrogelove na bazi amiloidnih fibrila i pružaju platformu za imobilizaciju proteina.

Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju pretraživača sa ograničenom podrškom za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Klizači koji prikazuju tri članka po slajdu.Koristite dugmad za nazad i sledeće da se krećete kroz slajdove ili dugmad kontrolora slajdova na kraju za kretanje kroz svaki slajd.

Specifikacija

310 10*1mm Dobavljači namotanih cijevi od nehrđajućeg čelika

Hemijski sastav

Mehanička svojstva

Rekombinantni proteini paukove svile (proteini paukove svile) imaju mnoge potencijalne primjene u razvoju novih biomaterijala, ali njihova multimodalna priroda i priroda sklona agregaciji čini ih teškim za nabavku i laku upotrebu.Ovdje izvještavamo da rekombinantni minijaturni spidroin proteini i, što je važno, sama N-terminalna domena (NT) brzo formiraju samonoseće i prozirne hidrogelove na 37 °C.fuzioni proteini koji se sastoje od NT i zelenog fluorescentnog proteina ili purin nukleozid fosforilaze formiraju potpuno funkcionalne fuzione proteine.Hidrogelovi.Naši rezultati pokazuju da rekombinantni NT i fuzioni proteini daju visoke prinose ekspresije i daju hidrogelovima atraktivna svojstva kao što su transparentnost, geliranje bez umrežavanja i direktna imobilizacija aktivnih proteina visoke gustine.
Pauci imaju čak sedam različitih skupova svilenih žlijezda, od kojih svaka proizvodi određenu vrstu svile.Svih sedam vrsta svile sastavljene su od proteina paukove svile (spidroina) dugih približno 6000 ostataka i sadrže veliki centralni ponovljeni region okružen sferičnim N- i C-terminalnim domenima (NT i CT)1,2.Najrašireniji tip svile, primarna ampula, proizvodi primarna ampula.U ovoj žlijezdi, monosloj epitelnih ćelija sintetizira proteine ​​spidroina i izlučuje ih u lumen žlijezde, gdje su prisutni u rastvorljivom obliku (doping) u ekstremno visokim koncentracijama (30-50% w/v)3,4.O organizaciji i konformaciji glavnih ampularnih spidroinskih proteina u žlijezdi se raspravljalo, ali većina eksperimentalnih dokaza ukazuje na prisustvo općenito spiralne i/ili nasumične spiralne konformacije i micelarne ili lamelarne strukture5,6,7,8,9,10.Dok repetitivni domeni regulišu mehanička svojstva svilenih vlakana, formirajući β-list nanokristale i amorfne strukture11,12,13,14,15, krajnji domeni regulišu svilena vlakna kao odgovor na promjenjive uslove duž svilene žlijezde16,17,18.Kontrolom formiranja svile, 19. Terminalni domeni su evolucijski očuvani i njihova funkcija može biti zajednička za sve spidroin proteine ​​2,20,21.Tokom prolaska kroz žlijezdu, pH spidroina se smanjuje sa oko 7,6 na < 5,716 i raste sa smicanjem i rastezanjem posredovanim kretanjem kroz kanal koji se postepeno sužava.U rastvoru, CT je α-helikalni konstitutivni paralelni dimer17, ali kao odgovor na nisku pH vrednost i sile smicanja, CT se razvija i prebacuje β-slojeve16, 17, moguće aktivirajući β-slojeve u repetitivnim regionima Convert 16. NT su monomerne pod uslove koji odražavaju uslove u lumenu žlezde i posreduju u rastvorljivosti spidroina, ali pri smanjenom pH, protonacija brojnih bočnih lanaca karboksilne kiseline dovodi do dimerizacije NT sa pKa od približno 6,5, čime se stabilizuje NT i fiksira spidroin u velikim količine.mreže16,18.Dakle, NT igra ključnu ulogu u formiranju filamenta, mijenjajući se od monomera u premazu u dimer u vlaknu23,24,25.NT ostaje visoko rastvorljiv i spiralan u svim do sada proučavanim uslovima16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, što je inspirisalo njegov razvoj kao oznake za povećanje rastvorljivosti za proizvodnju heterolognih proteina.
Rekombinantni mini protein svile pauka, koji se sastoji od jednog NT, jednog kratkog ponavljajućeg regiona, jednog CT i His6 oznake (His-NT2RepCT) za pročišćavanje, rastvorljiv je u vodenom puferu kao i prirodni protein svile pauka i oponaša prirodne važne karakteristike svilenog pauka .pokrivenost 25.31.His-NT2RepCT se može ispredati u kontinualna vlakna pomoću biomimetičke mašine u kojoj se premaz rastvorljiv sa pH 8 ekstrudira u vodeno kupatilo pH 525,32,33,34,35.Bioreaktorska fermentacija E. coli koja eksprimira His-NT2RepCT i naknadna obrada rezultirala je prinosom >14 g/L nakon prečišćavanja.Visok prinos, visoka rastvorljivost i adekvatan odgovor His-NT2RepCT na kisele uslove pripisuju se NT23, 25, 34.
Ovdje izvještavamo o brzom stvaranju prozirnih hidrogelova iz rekombinantnih proteina spidroina, uključujući samo NT, inkubacijom proteinske otopine na 37 °C.Koristeći fluorescenciju tioflavina T (ThT), infracrvenu spektroskopiju Fourierove transformacije (FTIR), spektroskopiju nuklearne magnetne rezonance (NMR) i transmisionu elektronsku mikroskopiju (TEM), otkrili smo da NT i mikropaukovi proteini prolaze strukturnu transformaciju u β-limove i fibrile slične amiloidu. kada se formiraju gelovi.Pored toga, fuzioni proteini NT i zelenog fluorescentnog proteina (GFP) ili purin nukleozid fosforilaze (PNP) formiraju hidrogelove sa potpuno funkcionalnim fuzionim fragmentima.Ekspresija visoke propusnosti u heterolognim domaćinima, zajedno sa brzim formiranjem hidrogelova u fiziološkim uslovima, otvara mogućnost isplative proizvodnje hidrogelova sa projektovanim funkcijama.
Za razliku od većine prijavljenih rekombinantnih spidroin proteina36, His-NT2RepCT je stabilan u Tris-HCl puferu na pH 8 i može se koncentrirati do 500 mg/mL bez taloženja25.Stoga smo bili iznenađeni kada smo otkrili da ovaj protein brzo formira optički čiste, samonoseće hidrogelove kada se inkubira na 37°C (slika 1b-d).Daljnje studije su pokazale da se His-NT2RepCT geliranje događa u širokom rasponu koncentracija proteina (10-300 mg/mL) i da je ova koncentracija u obrnutoj korelaciji sa vremenom geliranja (slika 1c i dodatna slika 1).Da bismo saznali koji dijelovi His-NT2RepCT posreduju u formiranju hidrogela, zatim smo ispitali svaki domen pojedinačno iu različitim kombinacijama koristeći test inverzije tikvice (slika 1a,b).Sve testirane frakcije rekombinantnog spidroina formirale su gelove (pri koncentraciji proteina od 300 mg/mL) za manje od 1 h, osim istaloženog 2Rep (slika 1b).Ovo sugerira da NT i CT sami, u kombinaciji ili povezani s ponavljanjima, mogu gelirati na 37°C i da His6 oznaka ne utječe na ovaj proces u bilo kojoj značajnoj mjeri.S obzirom na uobičajenu ideju da je NT visoko rastvorljiv i stabilan protein, i da su prethodni izvještaji o rekombinantnim spidroin hidrogelovima pripisivali efekte gelacije konformacijskim promjenama u ponavljajućim regijama i/ili CT, sam NT bi mogao.Otkriće geliranja bilo je neočekivano.Dodatna tabela 1) 37, 38, 39. Zanimljivo je da se NT već želirao u roku od 10 minuta pri koncentraciji od ≥ 300 mg/mL (slika 1c).Eksperimenti inverzije bočica s različitim koncentracijama NT pokazali su da pri >50 mg/mL otopina NT želira brže od His-NT2RepCT pri odgovarajućoj koncentraciji (w/v, Slika 1c).
Šematski prikaz različitih spidroinskih konstrukata proučavanih u ovom radu.b Vrijeme geliranja na 37 °C za različite rekombinantne spidroin proteine ​​(300 mg/mL) potvrđeno okretanjem bočice.CT gel odmah bez inkubacije (<300 mg/mL), 2Rep precipitata (300 mg/mL, 5 mm skala).c Vrijeme geliranja His-NT2RepCT i NT pri naznačenim koncentracijama proteina na 37°C.d Fotografije His-NT2RepCT i NT hidrogelova sa paukom i slovom “NT” odštampanim ispod, respektivno (obe 200 mg/mL, skala bar 5 mm).
Hidrogelovi formirani od različitih rekombinantnih proteina spidroina imaju malo različite boje, a posmatranje golim okom pokazuje različite stepene transparentnosti (slika 1b).NT gelovi su izuzetno bistri dok ostali gelovi postaju neprozirni.His-NT2RepCT i NT gelovi izliveni u cilindrične cijevi mogu se izvaditi iz kalupa netaknuti (slika 1d).
Kako bi se testiralo da li se prirodni premazi od paukove svile geliraju u uvjetima za koje je sada utvrđeno da uzrokuju geliranje rekombinantnih proteina spidroina, prevlake su sakupljene iz velike ampulne žlijezde švedskog pauka mosta (Larinioides sclopetarius).Oblozi su pohranjeni u 20 mM Tris-HCl puferu pri 50 mg/mL (na osnovu izmjerene suhe težine), ali nije uočeno geliranje tokom 21-dnevne inkubacije na 37 °C (dodatna slika 2a).
Za kvantificiranje ovih gelova, reološka mjerenja se mogu koristiti za proučavanje procesa geliranja i određivanje ukupnih mehaničkih svojstava.Konkretno, praćenje modula skladištenja (elastičnosti) na povišenim temperaturama može pružiti informacije o temperaturi želiranja, kao i viskoelastičnim svojstvima premaza.Eksperimenti sa porastom temperature (koristeći 1°C/min na 25-45°C, na osnovu prethodnih studija korišćenjem rastvora prirodne svile)40,41 pokazali su da se moduli skladištenja His-NT2RepCT i NT rastvora povećavaju sa povećanjem temperature.je povećan (slika 2 i dopunska slika 3).Primetno je da je NT modul počeo da raste na nižoj temperaturi u poređenju sa His-NT2RepCT, što je u skladu sa bržim vremenom gela uočenog kada je NT direktno inkubiran sa His-NT2RepCT na 37°C (Slika 1).Nakon naknadnog pada temperature, modul skladištenja se nije vratio na niže vrijednosti i ostao je iznad modula gubitka (vidi dodatnu sliku 3), što ukazuje na termički ireverzibilnu stabilnu gelaciju.Nakon geliranja, konačni modul elastičnosti kretao se od 15 do 330 kPa za His-NT2RepCT hidrogelove u koncentraciji od 100-500 mg/mL, a konačni modul elastičnosti za NT hidrogelove (100-500 mg/mL) bio je u rasponu od 2 do 1400 kPa (sl. , 2 i kompletni podaci rampe) vidi dodatnu sliku 3).
a Promjena temperature tokom mjerenja His-NT2RepCT (300 mg/mL) i b NT (300 mg/mL) uz mućkanje.Strelice pokazuju temperaturni trend, a svjetlije sjenčanje podataka modula za pohranu prikazuje testiranje na nižim vrijednostima obrtnog momenta za instrument od onih koje je naveo proizvođač, što je uzrok povećane buke.c Akumulacija His-NT2RepCT i NT u krajnjem modulu nakon povišene temperature (100, 300 i 500 mg/mL).Sva očitavanja modula se uzimaju na frekvenciji od 0,1 Hz.
Kao potencijalnu metodu za istraživanje konformacijskih promjena povezanih sa geliranjem, snimili smo FTIR spektre His-NT2RepCT i NT prije i poslije geliranja na 37°C (Slika 3a,b).Kao što se očekivalo, spektri rastvora His-NT2RepCT i NT odgovarali su proteinima koji pokazuju sekundarnu strukturu α-heliksa/nasumične spirale, sa izraženom trakom na 1645 cm-1.Za oba hidrogela, geliranje je rezultiralo formiranjem dva kraka u srednjem I pojasu na oko 1617 cm-1 i 1695 cm-1 (sl. 3a, b), što ukazuje na formiranje antiparalelnih struktura β-listova.Ove promjene se također mogu jasno vidjeti u odgovarajućim spektrima geliranja drugog derivata i razlike (dopunska slika 4b).Dvije trake NT β-sloja bile su izraženije od onih na His-NT2RepCT, što ukazuje da je ukupan sadržaj traka β-sloja u NT hidrogelu bio veći od onog u NT2RepCT hidrogelu.
FTIR apsorpcijski spektri His-NT2RepCT i b NT (oba 500 mg/mL) prije (rastvor) i nakon (gel) inkubacije na 37°C.c TEM slike resuspendiranih 50 mg/ml NT2RepCT gela i d NT.Bar 200 nm.e Prečnici vlakana His-NT2RepCT i NT hidrogelova.n = 100 izmjerenih fibrila, p < 0,0001.Trake grešaka pokazuju standardnu ​​devijaciju.Središte traka grešaka je srednja vrijednost.Za statističku analizu korišten je neupareni t-test (dvostrani).f ThT fluorescencija različitih rekombinantnih spidroin proteina (100 mg/mL) na 37 °C bez mućkanja.g NT (100 mg/mL) eksperimenti inokulacije iz 100 mg/mL NT gela sa 0%, 5%, 10% i 20% sjemena.
Analiza gela primenom transmisione elektronske mikroskopije (TEM) pokazala je da se hidrogel sastoji od fibrila sličnih amiloidu (sl. 3c, 3d).NT-formirane fibrile bile su izdužene (5-12 nm u prečniku) i nerazgranate, dok su His-NT2RepCT fibrili kraće dužine i značajno šireg prečnika (7-16 nm) (slika 3e).Ovi rezultati su nam omogućili da pratimo kinetiku fibroze koristeći tioflavin T (ThT) test.Za sve rekombinantne spidroin proteine, fluorescentni signal se povećao kada su uzorci inkubirani na 37 °C (slika 3f, dodatna slika 5a).U skladu s ovim nalazom, mikroskopsko ispitivanje NT i His-NT2RepCT u uvjetima želiranja otkrilo je ujednačeno povećanje fluorescencije ThT bez primjetne lokalne akumulacije ThT-pozitivnih agregata (dopunska slika 5b,c).Formiranje ThT-pozitivnih fibrila nije bilo praćeno povećanjem zamućenosti NT i His-NTCT (dopunska slika 5d), što znači da bi se mreža fibrila u gelu mogla formirati bez ugrožavanja čistoće gela.Zasijavanje dodavanjem malih količina prethodno formiranih fibrila može značajno ubrzati formiranje fibrila nekih amiloida42,43,44, ali dodavanjem 5%, 10% ili 20% (w/w) NT u otopinu NT hidrokoagulanata.efekat zasijavanja (slika 3g).Možda je to zbog činjenice da su fibrile u hidrogelu relativno fiksirane i ne mogu se koristiti kao sjemenke.
Neočekivano ponašanje rekombinantnih spidroin proteina na visokim temperaturama potaknulo je daljnje studije spektroskopije nuklearne magnetne rezonance (NMR) kako bi se identificirale konformacijske promjene povezane s formiranjem gela.NMR spektri rastvora His-NT2RepCT snimljeni tokom vremena na 37°C pokazali su da je CT još uvijek djelomično presavijen, dok su NT i 2Rep signali nestali (slika 4a), što sugerira da su uglavnom NT i 2Rep ti koji djelomično kontroliraju formiranje His- NT2RepCT hidrogel.CT signal je također oslabljen na 20% svog prvobitnog intenziteta, što sugerira da je CT također uglavnom fiksiran i ugrađen u strukturu hidrogela.Za manji dio CT-a, koji je mobilan kao u prethodno inkubiranom uzorku i na taj način promatran NMR-om otopine, u spektrima nedostaju signali za prvih 10 strukturiranih ostataka, vjerovatno zbog teške imobilizacije pričvršćenog dijela His-NT2Rep.NMR spektri -stanja hidrogelova -NT2RepCT otkrili su dominantno prisustvo α-heliksa i β-slojeva i, u manjoj mjeri, slučajnu konformaciju zavojnice (slika 4b).Analiza hemijskog pomaka ostataka metionina prisutnih samo u NT pokazala je da je ovaj domen pretvoren u β-list strukturu.Vremenski ovisni spektri NT u rastvoru pokazali su ujednačeno smanjenje intenziteta signala (slika 4c), a NMR u čvrstom stanju NT hidrogelova je pokazao da je većina ostataka NT pretvorena u strukture β-lista (slika 4d).Konformacija 2Rep nije mogla biti odvojeno određena zbog njegove sklonosti agregiranju.Međutim, NMR spektri čvrstog stanja NTCT i His-NT2RepCT hidrogela izgledali su vrlo slično (slika 4b; dodatna slika 6b), što sugerira da 2Rep malo doprinosi strukturnom dijelu His-NT2RepCT hidrogela.Za CT hidrogelove, utvrđeno je da postoje α-helike, β-limovi i nasumične spiralne sekundarne strukture (dopunska slika 6d).Ovo sugerira da neki dijelovi CT-a ostaju α-heliksa dok drugi postaju β-limovi.Dakle, rezultati NMR spektroskopije sugerišu da je NT važan za formiranje hidrogela i da se takođe transformiše u konformaciju β-lista nakon fuzije sa 2Rep i CT.U skladu s tim, nedavno smo otkrili da se amiloidni prostorni zatvarači vjerovatno formiraju u svih pet spirala NT domena, a Waltz algoritam je predvidio amiloidogenu regiju u heliksu 1 (slika 4e).
2D spektri rastvora 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT prije (plavo) i 19 sati nakon inkubacije (crveno) na 37°C.Pojedinačni ukršteni vrhovi u crvenom spektru i F24, G136, poliA u plavom spektru su označeni jednoslovnim simbolima aminokiselina i brojevima ostataka.Insetovi pokazuju zavisnost intenziteta signala od vremena za odabrane ostatke iz NT, 2Rep i CT domena.b Radiofrekventni spektri čvrstog stanja (RFDR) His-NT2RepCT hidrogelova.Korelacije ostataka Cα/Cβ uočene u RFDR spektrima određene su poređenjem sa hemijskim pomacima modela peptida i vrijednostima izvedenim iz statistike82,83 i njihovim sekundarnim strukturama.SSB – rotirajući bočni pojas.c Jednodimenzionalni spektri rastvora 15N-HSQC 10 mg/mL NT tokom inkubacije na 37 °C tokom 36 sati.Umetak prikazuje volumetrijski intenzitet u odnosu na vrijeme.d RFDR spektri čvrstog stanja NT hidrogelova.Prikazane su korelacije ostataka Cα/Cβ i njihovih sekundarnih struktura uočene u RFDR spektrima.e Na osnovu profila sklonosti fibrilaciji NT45.79 iz Zipper baze podataka (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Rosetta energija prozora prostornog pomaka munje heksapeptida prikazana je u kcal/mol.Crvene trake označavaju heksapeptide sa visokom sklonošću fibrozi (Rosetta energija ispod -23 kcal/mol; ispod isprekidane linije).Zelene trake označavaju fragmente sa Rosetta energijama iznad praga i stoga je manje vjerovatno da će formirati sterične patentne zatvarače.Fragmenti koji sadrže prolin isključeni su iz analize (bez kolona).Kvadrati označavaju područja amiloidoze predviđene Waltz algoritmom81 (https://waltz.switchlab.org).Slijed aminokiselinskih ostataka NT je na vrhu, a tipovi ostataka koji se nalaze u β sekundarnoj strukturi (utvrđeni NMR spektroskopijom u čvrstom stanju) prikazani su crvenom bojom.Položaji pet NT α-heliksa označeni su kao (H1-H5)28.
Pri pH <6,5, HT dimerizira, otporan je na denaturaciju uzrokovanu toplinom ili ureom18.Da bi se razjasnilo kako dimerizacija i stabilnost NT utiču na geliranje, rastvori koji sadrže 100 mg/ml NT su kontrolisani na pH 8, 7 i 6 pomoću testa inverzije bočice.NT uzorci inkubirani na pH 8 i 7 su gelirani nakon 30 minuta na 37 °C, ali je pH 8 gel ostao bistar, dok je pH 7 gel pokazao vidljivi talog (slika 5a).Nasuprot tome, otopina koja sadrži HT pri pH 6 nije formirala gel, a veliki talog se mogao vidjeti nakon 20 minuta na 37°C.Ovo sugerira da sami dimeri i/ili njihova veća stabilnost u odnosu na monomere sprječavaju geliranje.Formiranje precipitata za NT pri pH 7 i 6 nije se očekivalo, jer je objavljeno da je NT rastvorljiv pri 200 mg/ml27, lako se ponovo savija nakon toplotne denaturacije, a takođe zadržava α-helix pri nižim vrednostima pH 18. Vjerovatno objašnjenje za ova odstupanja je da su prethodno prijavljeni eksperimenti izvedeni na sobnoj temperaturi ili nižoj, ili pri relativno niskim koncentracijama proteina16,18,19.
NT test inverzije bočice (100 mg/mL) na pH 8, 7, 6 i 154 mM NaCl (pH 8) nakon inkubacije na 37°C.b NT CD spektri sa i bez 154 mM NaF i 154 mM NaCl, respektivno.Molarna eliptičnost na 222 nm se pretvara u udio prirodnih nabora.c Test inverzije NT (100 mg/mL) NT* (37 °C i 60 °C), NTA72R (37 °C) i His-NT-L6 (37 °C i 60 °C).d CD spektri NT mutanata NT*, NTA72R i His-NT-L6.Molarna eliptičnost na 222 nm se pretvara u udio prirodnih nabora.e Test inverzije NTFlSp, NTMiSp i smanjenog NTMiSp (100 mg/mL).Skala bar 5 mm.f CD spektri NT, NTFlSp, NTMiSp i redukovanog NTMiSp.Molarna eliptičnost na 222 nm se pretvara u udio prirodnih nabora.Puni NT spektri na 25 °C i 95 °C prikazani su na dodatnoj slici 8.
Fiziološka koncentracija soli određuje elektrostatičke interakcije između NT podjedinica i dimerizaciju prijenosa NT na niži pH18.Otkrili smo da prisustvo 154 mM NaCl i NaF zaista inhibira gelaciju (Slika 5a, b; Dodatna slika 2b) i da ove soli povećavaju termičku stabilnost NT monomera (Slika 5b, Dodatna slika 8) .Također sugerira da poboljšanje stabilnosti, a ne dimerizacija, sprječava stvaranje gela.
Da bismo dalje istražili ulogu dimerizacije i stabilnosti proteina u geliranju, koristili smo dva mutanta, NT* i NTA72R, koji također ostaju monomerni pri niskom pH 28,30.NT* je mutant dvostrukog naelektrisanja kod kojeg je prividna dipolarna raspodjela naboja monomera izravnana, što sprječava dimerizaciju i drastično povećava stabilnost monomera.NTA72R je nabijeni dipol, ali Arg-supstituirana Ala se nalazi na granici dimera, tako da mutacije ometaju interakcije podjedinica koje su potrebne za dimerizaciju.Nakon inkubacije na 37°C, NT* nije formirao hidrogel, dok je NTA72R formirao neprozirni gel tokom 15 minuta (slika 5c).Budući da i NT* i NTA72R ne mogu dimerizirati, ali se razlikuju u stabilnosti monomera (slika 5d), ovi rezultati snažno sugeriraju da visoka termodinamička stabilnost sprječava NT od želiranja.Tome u prilog govori i činjenica da HT* formira gel kada je nestabilan na visokoj temperaturi (nakon 8 minuta na 60°C; slika 5c).Ranije je pokazano da visok sadržaj metionina u NT ukapljuje njegovo prirodno savijanje i da šest Met to Leu supstituta (ovdje se pominju kao His-NT-L6) snažno stabiliziraju NT46 monomer.Na osnovu pretpostavke da je strukturna fleksibilnost potrebna za formiranje NT gela, otkrili smo da His-NT-L6 stabilni mutant nije gelirao na 37 °C (Slika 5c, d).Međutim, His-NT-L6 je takođe formirao gel nakon inkubacije na 60°C tokom 60 minuta (slika 5c).
Sposobnost NT-a da se transformiše u strukture β-lista i formira hidrogelove, čini se da se primjenjuje na neke, ali ne sve NT domene spidroina.NT iz različitih tipova svile i vrsta pauka, Trichonephila clavipes (NTFlSp), formirale su gelove uprkos njihovom relativno niskom sadržaju metionina i visokoj termičkoj stabilnosti (Slika 5e, f i Dodatna tabela 2).Nasuprot tome, NT iz malog ampularnog proteina spidroina iz Araneus ventricosus (NTMiSp) sa niskom termičkom stabilnošću i visokim sadržajem metionina nije formirao hidrogelove (dopunska tabela 2 i slika 5e, f).Ovo posljednje može biti povezano s prisustvom intramolekularnih disulfidnih veza29,47.Konzistentno, kada su disulfidne veze NTMiSp smanjene, formirao je hidrogel nakon inkubacije na 37°C tokom 10 minuta (slika 5e).U zaključku, treba napomenuti da je strukturna fleksibilnost važan, ali ne i jedini kriterij za formiranje gela iz NT.Drugi faktor koji bi mogao biti relevantan je sklonost formiranju amiloidnih fibrila, a analiza sa bazom podataka sa zatvaračem i Waltz algoritmom je pokazala korelaciju između sposobnosti formiranja gelova i prisustva amiloidogenih regija, kao i opsega predviđenih regija. za formiranje steričnih patentnih zatvarača.Postojala je korelacija (dopunska tabela 2 i dodatna slika 9).
Sposobnost NT da formira fibrile i formira gelove pod povoljnim uslovima dovela nas je do hipoteze da fuzije NT sa drugim proteinskim fragmentima i dalje mogu formirati gelove sa punom funkcijom partnera fuzije.Da bismo ovo testirali, uveli smo zeleni fluorescentni protein (GFP) i purin nukleozid fosforilazu (PNP) na C-terminusu NT, respektivno.Rezultirajući fuzioni proteini su eksprimirani u E. coli s vrlo visokim konačnim prinosima (150 mg/L i 256 mg/L mućkastih kultura za His-NT-GFP i His-NT-PNP, respektivno), u skladu s onim što je pokazano za druge proteine ​​spojene na NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) i His-NT-PNP (100mg/mL) fuzioni proteini su formirali gelove nakon 2 sata i 6,5 sati na 37°C i, što je važno, GFP frakcija je ostala nepromijenjena.uočeno nakon geliranja, sa >70% početnog intenziteta fluorescencije preostalog nakon geliranja (slika 6a).Da bismo izmerili aktivnost PNP u rastvorima i gelovima his-NT-PNP, morali smo da razblažimo fuzioni protein sa NT jer je enzimska aktivnost čistog preparata bila izvan opsega detekcije testa pri koncentracijama želiranja.Gel formiran mješavinom koja sadrži 0,01 mg/mL His-NT-PNP i 100 mg/mL NT zadržao je 65% početne enzimske aktivnosti prethodno inkubiranih uzoraka (slika 6b).Gel je ostao netaknut tokom merenja (dopunska slika 10).
a Relativni intenzitet fluorescencije prije i nakon geliranja His-NT-GFP (300 mg/mL) i preokrenute bočice koja sadrži His-NT-GFP hidrogel (300 mg/mL) pod vidljivim i UV svjetlom.Tačke pokazuju pojedinačna mjerenja (n = 3), trake greške pokazuju standardnu ​​devijaciju.Prosječna vrijednost je prikazana u sredini traka grešaka.b PNP aktivnost je dobijena fluorometrijskom analizom upotrebom rastvora i gelova koji se sastoje od NT (100 mg/ml) i mešavine koja sadrži 0,01 mg/ml his-NT-PNP i 100 mg/ml novih tajvanskih dolara.Umetak prikazuje preokrenutu bočicu koja sadrži hidrogel koji sadrži His-NT-PNP (5 mm skala bar).
Ovdje izvještavamo o formiranju hidrogelova iz NT i drugih rekombinantnih spidroin proteina inkubacijom proteinske otopine na 37°C (Slika 1).Pokazali smo da je geliranje povezano sa transformacijom α-heliksa u β-slojeve i formiranjem fibrila sličnih amiloidu (slike 3 i 4).Ovaj nalaz je iznenađujući jer su NT smotani globularni snopovi sa pet spirala poznati po svojoj izuzetno visokoj rastvorljivosti i visokoj stabilnosti pri koncentracijama >200 mg/mL na 4°C tokom nekoliko dana27.Osim toga, NT se lako ponovo savijaju nakon toplinske denaturacije pri niskim koncentracijama proteina u µM.Prema našim rezultatima, formiranje fibrila zahtijeva kombinaciju >10 mg/mL koncentracije proteina i blago povišene temperature (slika 1).Ovo je u skladu sa idejom da se amiloidna fibrila mogu formirati od globularno presavijenih proteina koji su u delimično nesavijenom stanju usled termičkih fluktuacija u fiziološkim uslovima 48 .Primjeri proteina koji prolaze kroz ovu konverziju uključuju inzulin49,50, β2-mikroglobulin, transtiretin i lizozim51,52,53.Iako je NT α-heliks u svom prirodnom stanju, otprilike 65% polipeptidnog lanca je kompatibilno sa formiranjem steričkog zatvarača (slika 4e) 45 .Budući da je monomer dinamički pokretljiv46, može izložiti ove potencijalne amiloidogene regije na umjereno povišenim temperaturama i pri visokim koncentracijama ukupnog proteina može dostići kritičnu koncentraciju za formiranje amiloidnih fibrila54.Slijedeći ovo rezonovanje, pronašli smo negativnu korelaciju između koncentracije spidroina i vremena geliranja (slika 1c), a ako je monomerna NT konformacija stabilizirana ili mutacijama (NT*, His-NT-L6) ili dodavanjem soli, može spriječiti formiranje hidrogelova (slika 5).
U većini slučajeva, amiloidni fibrili nestaju iz otopine kao talog, ali pod određenim uvjetima mogu formirati hidrogelove55,56,57.Vlakna koja formiraju hidrogel obično imaju visok omjer širine i visine i formiraju stabilne trodimenzionalne mreže kroz molekularno preplitanje,55,58 u skladu s našim rezultatima.Za formiranje hidrogela in vitro, proteini se često potpuno ili djelomično otvaraju, na primjer, izlaganjem organskim rastvaračima, visokoj temperaturi (70–90°C) i/ili niskom pH (1,5–3,0)59,60,61,62.Ovdje opisani spidroin hidrogelovi ne zahtijevaju grubu obradu, niti im je potrebna sredstva za umrežavanje za stabilizaciju hidrogelova.
Ranije je objavljeno da ponavljanja spidroina i QD, za koje se čini da prolaze kroz prebacivanje β-listova tokom predenja svile, formiraju hidrogelove.U poređenju s našim nalazima, vremena inkubacije i/ili temperature inkubacije su bile značajno duže ili više, a rezultirajući hidrogelovi su često bili neprozirni (slika 7 i dodatna tabela 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Osim brzih vremena geliranja, NT hidrogelovi >300 mg/mL (30%) nadmašili su sve ostale opisane hidrogelove rekombinantnog proteina paukove svile, kao i prirodne hidrogelove kao što su želatin, alginat (2%), agar (0,5%) ) i kolagen.(0,6%) (Slika 7 i dopunske tabele 1 i 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Vrijeme geliranja i modul elastičnosti hidrogelova u ovoj studiji upoređeni su s drugim hidrogelovima na bazi spidroina i odabranim prirodnim hidrogelovima.Reference su date zajedno sa opisom uslova geliranja.APS Amonijum persulfat, sobna temperatura.Podaci 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Čini se da su pauci razvili načine da spriječe geliranje spidroina tokom skladištenja.Unatoč visokoj koncentraciji proteina u svilenoj žlijezdi, velika ponovljena regija povezana s terminalnom domenom znači da prividna koncentracija NT i CT u žlijezdi odgovara približno 10-20 mg/ml, na granici ove studije.potrebno za in vitro uočeno formiranje hidrogela.Osim toga, slične koncentracije soli 16 stabilizirale su NT, kao u svilenim žlijezdama (slika 5b).Konformacija NT je proučavana u citosolu E. coli i utvrđeno je da je čvršće savijena nego kada je ispitana in vitro, što dalje ukazuje da sol ili drugi faktori sprečavaju njegovu agregaciju in vivo.Međutim, sposobnost NT-a da se transformišu u β-listne fibrile može biti važna za formiranje filamenta i treba je istražiti u budućim studijama.
Pored novih aspekata formiranja fibrila sličnih NT-amiloidu i hidrogela uočenih u ovoj studiji, takođe pokazujemo da ovaj fenomen može imati biotehnološku i biomedicinsku primenu (slika 8).Kao dokaz koncepta, kombinovali smo NT sa GFP ili PNP i pokazali da fuzioni protein takođe formira hidrogelove kada se inkubira na 37 °C i da frakcije GFP i PNP uglavnom zadržavaju svoju aktivnost nakon geliranja (slika 6).Nukleozidne fosforilaze su važni katalizatori sinteze nukleozidnih analoga75, što naše otkriće čini relevantnim za biofarmaceutsku industriju.Koncept ekspresije fuzionih proteina koji formiraju prozirne hidrogelove pod povoljnim uslovima omogućava stvaranje funkcionalizovanih hidrogelova sa povoljnim svojstvima za širok spektar primena kao što su imobilizacija enzima, kontrolisano oslobađanje leka i inženjering tkiva.Osim toga, NT i NT* su efikasni markeri ekspresije30, što znači da se NT i njegove varijante mogu koristiti za proizvodnju topljivih fuzionih proteina visoke propusnosti i naknadno stvaranje imobiliziranih ciljnih proteina u 3D hidrogelovima.
NT je rastvorljiv, α-helikalni i stabilan pri niskim koncentracijama (µM) i 37°C.Na istoj temperaturi, ali pri rastućim koncentracijama (>10 mg/ml), NT formira gelove koji se sastoje od fibrila sličnih amiloidu.NT fuzioni proteini također formiraju fibrilarne gelove s potpuno funkcionalnim fuzionim fragmentima, omogućavajući različitim proteinima da budu imobilizirani u 3D hidrogelovima koristeći NT.Dole: NT (PDB: 4FBS) i ilustracije mreža vlakana i povezanih proteinskih struktura (pretpostavljeno i nije nacrtano u mjerilu, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2).
Konstrukti (vidi Dodatnu tabelu 4 za kompletnu listu uključujući sekvence aminokiselina) su klonirani u plazmid pT7 i transformisani u E. coli BL21 (DE3).E. coli koji sadrže konstruirane plazmide inokulirane su u Luria bujonu sa dodatkom kanamicina (70 mg/l) i uzgajane preko noći na 30°C i 250 rpm.Kultura je zatim inokulirana 1/100 u LB medijum koji sadrži kanamicin i kultivisan na 30°C i 110 rpm dok OD600 nije dostigao 0,8.Za NMR studije, bakterije su uzgajane u minimalnom mediju M9 koji sadrži 2 g D-glukoze 13C (Aldrich) i 1 g amonijum hlorida 15N (Cambridge Isotop Laboratories, Inc.) za obeležavanje proteina izotopima.Smanjite temperaturu na 20 stepeni Celzijusa i potaknite ekspresiju proteina sa 0,15 mM izopropiltiogalaktopiranozida (konačna koncentracija).Nakon ekspresije proteina preko noći, ćelije su sakupljene na 7278×g, 4°C tokom 20 minuta.Ćelijske pelete su resuspendirane u 20 mM Tris-HCl, pH 8, i zamrznute do daljnje upotrebe.Odmrznute ćelije su lizirane upotrebom disruptora ćelija (mašine serije TS, Constant Systems Limited, Engleska) na 30 kPa.Zatim su lizati centrifugirani na 25.000 g tokom 30 minuta na 4°C.Za NTMiSp, pelet je zatim resuspendiran u 2 M uree, 20 mM Tris-HCl, pH 8, i obrađen ultrazvukom 2 minute (2 s uključeno/isključeno, 65%), a zatim ponovo centrifugiran na 25,000 xg, 4°C unutar 30 min.Supernatant je stavljen na Ni-NTA kolonu, ispran sa 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazola, pH 8, i konačno je protein eluiran sa 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazola, pH 8. Da bi se stvorio NT2RepCT i NTCT, varenje trombina uvodi mjesto (ThrCleav) između His i NT.Mjesta cijepanja trombina su također prisutna u His-NT-ThrCleav-2Rep (proizvodi 2Rep), His-tioredoksin-ThrCleav-NT (proizvodi NT), His-tioredoksin-ThrCleav-CT (proizvodi CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (proizvodi NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (proizvodi NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (proizvodi NTF1Sp) i His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (proizvodi NTMiSp).Konstrukti su digestirani trombinom (1:1000) i dijalizirani preko noći na 4°C sa 20 mM Tris-HCl, pH 8, korištenjem Spectra/Por dijalizne membrane s pragom molekularne težine od 6-8 kDa.Nakon dijalize, otopina se stavlja na Ni-NTA kolonu i sakuplja se efluent koji sadrži protein od interesa.Koncentracije proteina određene su mjerenjem UV apsorbancije na 280 nm koristeći koeficijent ekstinkcije svakog proteina, osim za NTF1Sp, koji je koristio Bradfordov test prema protokolu proizvođača.Čistoća je određena SDS poliakrilamidnom (4-20%) gel elektroforezom i Coomassie briljantno plavim bojenjem.Proteini su koncentrirani pomoću filtera za centrifugiranje (VivaSpin 20, GE Healthcare) na 4000 xg sa 10 kDa molekularnom težinom u ciklusima od 20 minuta.
Odmrznite proteinski rastvor i pažljivo pipetirajte 150 µl u prozirnu bočicu od 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Epruvete su začepljene i zapečaćene parafilmom kako bi se spriječilo isparavanje.Uzorci (n = 3) su inkubirani na 37°C ili 60°C i periodično invertirani da bi se uočila gelacija.Uzorci koji nisu gelirali su inkubirani najmanje jednu sedmicu.Smanjite NTMiSp disulfidne veze sa 10 mM DTT po 10 µM proteina.Za analizu geliranja prirodnih premaza od paukove svile, švedski most pauk je isječen, dvije glavne ampulirane žlijezde su stavljene u 200 μl 20 mM Tris-HCl pufera pH 8 i izrezane kako bi se omogućilo da se premaz odvoji od žlijezda..Sadržaj žlijezda je otopljen u puferu, 50 µl za određivanje suhe težine (inkubacijom otvorenih bočica na 60 °C do konstantne težine) i 150 µl za geliranje na 37 °C.
Merna geometrija/alat je napravljen od nerđajućeg čelika pomoću paralelne ploče sa gornjim prečnikom od 20 mm i razmakom od 0,5 mm.Zagrijte uzorak od 25 °C do 45 °C i nazad na 25 °C brzinom od 1 °C u minuti koristeći donju Peltier ploču od nehrđajućeg čelika.Mjerenja vibracija vršena su na frekvenciji od 0,1 Hz iu linearnom viskoelastičnom području materijala pri naprezanju od 5% i 0,5% za uzorke od 100 mg/mL i 300–500 mg/mL, respektivno.Koristite prilagođenu komoru za vlažnost kako biste spriječili isparavanje.Podaci su analizirani pomoću Prism 9.
Za prikupljanje infracrvenih (IR) spektra na sobnoj temperaturi od 800 do 3900 cm–1.ATR uređaj, kao i put svjetlosti kroz spektrometar, se pročišćavaju suhim filtriranim zrakom prije i za vrijeme eksperimenta.Rastvori (500 mg/mL da bi se minimizirali pikovi apsorpcije vode u spektrima) su pipetirani na kristale, a gelovi (500 mg/mL) su formirani prije mjerenja i zatim prebačeni u kristale (n = 3).Snimljeno je 1000 skeniranja sa rezolucijom od 2 cm-1 i nultim radnim ciklusom od 2. Druga derivacija je izračunata pomoću OPUS-a (Bruker) koristeći raspon izglađivanja od devet tačaka.Spektri su normalizovani na istu integracijsku oblast između 1720 i 1580 cm-1 korišćenjem F. Mengesa “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”.U ATR-IR spektroskopiji, dubina prodiranja infracrvenog snopa u uzorak zavisi od talasnog broja, što rezultira jačom apsorpcijom na nižim talasnim brojevima nego na višim talasnim brojevima.Ovi efekti nisu korigovani za spektre prikazane na sl.3 jer su vrlo male (dopunska slika 4).Korigovani spektri za ovu cifru su izračunati pomoću softvera Bruker OPUS.
U principu, sveobuhvatna kvantifikacija proteinskih konformacija je moguća nakon pouzdane dekonvolucije komponenti unutar pika amida I.Međutim, u praksi se javljaju neke prepreke.Šum u spektru se može pojaviti kao (lažni) vrhovi tokom dekonvolucije.Osim toga, vrh zbog savijanja vode poklapa se sa pozicijom pika amida I i može imati sličnu veličinu za uzorke koji sadrže veliku količinu vode, kao što je vodeni gel koji se ovdje proučava.Stoga, nismo pokušali da u potpunosti razgradimo pik amida I, i naša zapažanja treba uzeti u obzir samo kao podršku drugim metodama kao što je NMR spektroskopija.
Rastvori od 50 mg/ml NT i His-NT2RepCT su gelirani preko noći na 37°C.Hidrogel je zatim razrijeđen sa 20 mM Tris-HCl (pH 8) do koncentracije od 12,5 mg/ml, dobro promućkan i pipetiran da se gel razbije.Zatim je hidrogel razrijeđen 10 puta sa 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl uzorka je naneseno na bakarnu rešetku obloženu formvarom, a višak uzorka je uklonjen papirom za upijanje.Uzorci su dva puta isprani sa 5 µl MilliQ vode i obojeni 1% uranil formatom 5 minuta.Uklonite višak mrlje upijajućim papirom, a zatim osušite mrežicu na zraku.Snimanje je obavljeno na ovim mrežama koristeći FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN koji radi na 100 kV.Slike su snimljene pri uvećanjima x 26.500 i x 43.000 pomoću Veleta 2k × 2k CCD kamere (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Njemačka).Za svaki uzorak (n = 1) snimljeno je 10–15 slika.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) je korišten za analizu slike i mjerenje prečnika vlakana (n = 100, različita vlakna).Prizma 9 je korištena za izvođenje neparnih t-testova (dvostranih).Srednja vrijednost His-NT2RepCT i NT fibrila iznosila je 11,43 (SD 2,035) i 7,67 (SD 1,389) nm, respektivno.Interval pouzdanosti (95%) je -4,246 do -3,275.stepeni slobode = 198, p < 0,0001.
80 µl tečnih uzoraka koji sadrže 10 µM tioflavina T (ThT) izmjereno je u tri primjerka (n = 3) u statičkim uvjetima korištenjem Corning ploča sa 96 jažica crnog dna (Corning Glass 3881, SAD).Fluorescentne razlike su snimljene korišćenjem ekscitacionog filtera od 440 nm i emisionog filtera od 480 nm (FLUOStar Galaxy iz BMG Labtech, Offenburg, Nemačka).ThT signal nije bio ni zasićen ni ugašen, jer su eksperimenti s različitim koncentracijama ThT izvedeni bez promjene intenziteta signala.Zabilježite apsorbanciju na 360 nm za mjerenje magle.Za eksperimente zasijavanja, gelovi od 100 mg/mL su formirani na 37°C, resuspendovani i korišteni za zasijavanje u molarnim omjerima od 5%, 10% i 20%.Podaci su analizirani pomoću Prism 9.
Odmrznite zalihe His-NT2RepCT i NT >100 mg/mL na ledu i filtrirajte kroz filter od 0,22 µm.Koncentracije su izračunate mjerenjem apsorbancije na 280 nm koristeći Nanodrop.U jažice crne nevezujuće ploče sa 96 jažica (Corning) sa čistim dnom, uzorci su razrijeđeni na 20 mg/ml u 20 mM Tris-HCl pH 8 i pomiješani sa 5 μM ThT (konačna koncentracija), ukupna koncentracija uzorka 50 μl zapremine.Uzorci su snimani svakih 10 minuta na 37 °C na CellObserver (Zeiss) mikroskopu sa transmitiranim svjetlosnim kanalom i setovima FITC ekscitacije i emisionih filtera za ThT snimanje.Za snimanje se koristi sočivo 20x/0,4.Za analizu slike korišteni su Zen Blue (Zeiss) i ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Gelovi su takođe pripremljeni od rastvora NT i His-NT2RepCT u koncentraciji od 50 mg/mL koji sadrže 20 mM Tris pH 8 i 5 µM ThT i inkubirani na 37°C tokom 90 minuta.Komadi gela su prebačeni u novu jažicu koja sadrži 20 mM Tris, pH 8 i 5 μM ThT u nevezujućoj crnoj ploči sa 96 jažica.Dobijte slike zelene fluorescencije i svijetlog polja pri uvećanju od 20x/0,4.ImageJ je korišten za analizu slike.
NMR spektri rastvora su dobijeni na 310 K na 600 MHz Bruker Avance Neo spektrometru opremljenom sa QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR uzorci koji sadrže 10 mg/mL homogenog proteina označenog sa 13C, 15N, otopljenog u 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Hemijski pomaci NT2RepCT pri pH 6,7 korišteni su za dodjelu pika 23 u 2D spektru 15N-HSQC.
Magični ugaoni NMR (MAS) spektri 13C, 15N-obilježenih hidrogelova snimljeni su na Bruker Avance III HD spektrometru na 800 MHz opremljenom sa 3,2 mm 13C/15N{1H} sondom bez elektrona.Temperatura uzorka je kontrolirana korištenjem struje plina varijabilne temperature na 277 K. Dvodimenzionalna dipolna rotirajuća rezonancija (DARR)76 i spektri radiofrekventne rekonekcije (RFDR)77 su dobijeni na MAS frekvencijama od 12,5 kHz i 20 kHz, respektivno.Unakrsna polarizacija (CP) od 1H do 13C izvedena je korištenjem linearne rampe od 60,0 do 48,0 kHz na 1H, 61,3/71,6 kHz na 13C (na 12,5/20 kHz MAS) i kontaktnog vremena 0,5-1 ms.Spinal6478 decoupling na 73,5 kHz je korišten tokom prikupljanja podataka.Vrijeme akvizicije je bilo 10 milisekundi, a kašnjenje ciklusa 2,5 sekunde.Jedno-povezane korelacije Cα/Cβ uočene u RFDR spektrima dodijeljene su na osnovu karakterističnih hemijskih pomaka tipa ostatka i višestruko povezanih korelacija u DARR spektrima.
Baza podataka Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) korištena je za procjenu tendencija treperenja i Rosetta energije za NT, NTFlSp i NTMiSp.Baza podataka Zipper izračunava Rosetta Energy80, koja kombinuje nekoliko funkcija besplatne energije za modeliranje i analizu strukture proteina.Energetski nivo od -23 kcal/mol ili niži ukazuje na visoku sklonost fibrilaciji.Manja energija znači veću stabilnost dva β-lanca u konformaciji patent zatvarača.Osim toga, Waltz algoritam je korišten za predviđanje amiloidogenih regija u NT, NTFlSp i NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Rastvor NT proteina je pomešan sa puferom 2-(N-morfolino)etansulfonske kiseline (MES) na pH 5,5 i 6,0 da bi se pH snizio na pH 6, odnosno 7.Konačna koncentracija proteina bila je 100 mg/ml.
Mjerenja su vršena na J-1500 CD spektrometru (JASCO, SAD) pomoću kivete od 300 μL sa optičkom putanjom od 0,1 cm.Proteini su razrijeđeni do 10 μM (n = 1) u 20 mM fosfatnom puferu (pH 8).Za analizu stabilnosti proteina u prisustvu soli, proteini su analizirani u istoj koncentraciji (n = 1) u 20 mM fosfatnom puferu (pH 8) koji sadrži 154 mM NaF ili NaCl, respektivno.Skeniranje temperature je snimljeno na 222 nm od 25°C do 95°C sa brzinom zagrijavanja od 1°C/min.Proporcija prirodno savijenih proteina izračunata je pomoću formule (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Dodatno, snimljeno je pet spektra za svaki uzorak od 260 nm do 190 nm na 25°C i nakon zagrijavanja na 95°C.Pet spektra je usrednjeno, izglađeno i konvertovano u molarnu eliptičnost.Podaci su analizirani pomoću Prism 9.
Intenzitet fluorescencije His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) mjeren je u tri primjerka (n = 3) u Corning pločama sa 96 jažica sa crnim providnim dnom (Corning Glass 3881, USA) u statičkim uslovima.Izmjerite uzorke čitačem ploča na bazi fluorescencije s talasnom dužinom ekscitacije od 395 nm i zabilježite emisiju na 509 nm prije geliranja i 2 sata kasnije na 37°C.Podaci su analizirani pomoću Prism 9.
Komplet za analizu aktivnosti purin nukleozid fosforilaze (fluorometrijska metoda, Sigma Aldrich) korišten je prema uputama proizvođača.Za mjerenje aktivnosti u gelovima i otopinama koje sadrže His-NT-PNP, pomiješajte 10 ng His-NT-PNP sa 100 mg/mL NT do ukupne zapremine od 2 µL jer je gel dao signal iznad intervala detekcije seta.Uključene su kontrole za gelove i rastvore bez His-NT-PNP.Mjerenja su obavljena dva puta (n = 2).Nakon što je aktivnost izmjerena, reakciona smjesa je uklonjena i gel fotografiran kako bi se osiguralo da je gel ostao netaknut tokom mjerenja.Podaci su analizirani pomoću Prism 9.
Za više informacija o dizajnu studije, pogledajte sažetak studije prirode povezan s ovim člankom.
Na slikama 1 i 2 prikazani su početni podaci.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f i 6, dopunske slike.3, dopunska sl.5a, d, dopunska sl.6 i dopunska sl.8. Podaci Podaci iz ove studije nalaze se u bazi podataka Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.NMR podaci dobijeni u ovoj studiji objavljeni su u spremište BMRBig pod ID unosa bmrbig36.Strukture GFP i PNP preuzete su iz PDB-a (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. i Johansson, J. Predenje umjetne paukove svile.National Chemical.biologija.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Genom Nephila clavipes naglašava raznolikost gena paukove svile i njihovu složenu ekspresiju.National Genette.49, 895–903 (2017).