304 kemijska komponenta cijevi zavojnice od nehrđajućeg čelika, struktura SPACA6 ektodomena sadrži očuvanu superfamiliju proteina povezanih sa fuzijom gameta.

Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju pretraživača sa ograničenom podrškom za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Klizači koji prikazuju tri članka po slajdu.Koristite dugmad za nazad i sledeće da se krećete kroz slajdove ili dugmad kontrolora slajdova na kraju za kretanje kroz svaki slajd.

SPACA6 je površinski protein izražen spermom koji je kritičan za fuziju gameta tokom seksualne reprodukcije sisara.Uprkos ovoj fundamentalnoj ulozi, specifična funkcija SPACA6 je slabo shvaćena.Razjašnjavamo kristalnu strukturu ekstracelularnog domena SPACA6 pri rezoluciji od 2,2 Å, otkrivajući dvodomenski protein sastavljen od četverolančanog snopa i Ig-sličnih β-sendviča spojenih kvazi-fleksibilnim linkerima.Ova struktura podsjeća na IZUMO1, još jedan protein povezan s fuzijom gameta, što čini SPACA6 i IZUMO1 osnivačima superfamilije proteina povezanih s oplodnjom koja se ovdje naziva IST superfamilija.IST superfamilija je strukturno definisana svojim uvrnutim snopom sa četiri spirale i parom disulfidno povezanih CXXC motiva.AlphaFold pretraga ljudskog proteoma zasnovana na strukturi identifikovala je dodatne članove proteina ove superfamilije;posebno, mnogi od ovih proteina su uključeni u fuziju gameta.Struktura SPACA6 i njen odnos s drugim članovima IST superfamilije predstavljaju kariku koja nedostaje u našem znanju o fuziji gameta sisara.
Svaki ljudski život počinje sa dvije odvojene haploidne gamete: očevim spermatozoidom i majčinim jajnim stanicama.Ova sperma je pobjednik intenzivnog procesa selekcije tokom kojeg milioni spermatozoida prolaze kroz ženski genitalni trakt, savladavaju različite prepreke1 i prolaze kroz kapacitaciju, čime se pojačava njihova pokretljivost i proces površinskih komponenti2,3,4.Čak i ako se sperma i oocita nađu, proces još nije završen.Oocita je okružena slojem kumulusnih ćelija i glikoproteinskom barijerom zvanom zona pellucida, kroz koju spermatozoidi moraju proći da bi ušli u oocitu.Spermatozoidi koriste kombinaciju površinskih adhezivnih molekula i enzima povezanih s membranom i izlučenih enzima kako bi prevladali ove konačne barijere5.Ovi molekuli i enzimi se uglavnom pohranjuju u unutrašnjoj membrani i akrosomalnom matriksu i otkrivaju se kada se vanjska membrana sperme lizira tokom akrosomalne reakcije6.Posljednji korak na ovom intenzivnom putovanju je fuzija spermatozoida i jajeta, u kojem dvije ćelije spajaju svoje membrane kako bi postale jedan diploidni organizam7.Iako je ovaj proces revolucionaran u ljudskoj reprodukciji, potrebne su molekularne interakcije slabo shvaćene.
Pored oplodnje gameta, hemija fuzije dva dvosloja lipida je opsežno proučavana.Općenito, fuzija membrane je energetski nepovoljan proces koji zahtijeva da proteinski katalizator prođe strukturnu promjenu konformacije koja približava dvije membrane, prekidajući njihov kontinuitet i uzrokujući fuziju8,9.Ovi proteinski katalizatori su poznati kao fuzogeni i pronađeni su u bezbrojnim fuzionim sistemima.Potrebni su za ulazak virusa u ćelije domaćina (npr. gp160 u HIV-1, porast u koronavirusima, hemaglutinin u virusima gripe)10,11,12 placente (sincitin)13,14,15 i fuzije koje formiraju gamete kod nižih eukariota ( HAP2/GCS1 u biljkama, protistima i člankonošcima) 16,17,18,19.Fuzogeni za ljudske gamete tek treba da budu otkriveni, iako se pokazalo da je nekoliko proteina kritično za vezivanje i fuziju gameta.CD9 eksprimiran u oocitima, transmembranski protein potreban za fuziju mišjih i ljudskih gameta, prvi je otkriven 21,22,23.Iako je njegova precizna funkcija i dalje nejasna, vjerojatnom se čini uloga u adheziji, strukturi adhezionih žarišta na mikroresicama jajeta i/ili ispravnoj lokalizaciji površinskih proteina oocita 24,25,26.Dva najtipičnija proteina koja su kritična za fuziju gameta su protein sperme IZUMO127 i protein oocita JUNO28, a njihovo međusobno povezivanje je važan korak u prepoznavanju i adheziji gameta prije fuzije.Mužjaci Izumo1 nokaut miševa i ženke Juno nokaut miševa su potpuno sterilni, kod ovih modela spermatozoidi ulaze u perivitelinski prostor, ali se gamete ne spajaju.Slično, konfluencija je smanjena kada su gamete tretirane anti-IZUMO1 ili JUNO27,29 antitijelima u eksperimentima in vitro oplodnje kod ljudi.
Nedavno je otkrivena novootkrivena grupa proteina eksprimiranih spermatozoida fenotipski sličnih IZUMO1 i JUNO20,30,31,32,33,34,35.Protein 6 povezan sa akrozomalnom membranom sperme (SPACA6) identifikovan je kao neophodan za oplodnju u velikoj studiji mišje mutageneze.Umetanjem transgena u gen Spaca6 nastaju netaljivi spermatozoidi, iako se ti spermatozoidi infiltriraju u perivitelinski prostor 36 .Naknadne nokaut studije na miševima potvrdile su da je Spaca6 potreban za fuziju gameta 30,32.SPACA6 je eksprimiran gotovo isključivo u testisima i ima obrazac lokalizacije sličan onome kod IZUMO1, naime unutar intime spermatozoida prije akrosomalne reakcije, a zatim migrira u ekvatorijalni region nakon akrosomalne reakcije 30,32.Spaca6 homolozi postoje kod raznih sisara i drugih eukariota 30 i njegova važnost za fuziju ljudskih gameta je dokazana inhibicijom ljudske oplodnje in vitro otpornošću na SPACA6 30 .Za razliku od IZUMO1 i JUNO, detalji strukture, interakcija i funkcije SPACA6 ostaju nejasni.
Kako bismo bolje razumjeli fundamentalni proces koji leži u osnovi fuzije ljudske sperme i jajnih ćelija, a koji će nam omogućiti da informišemo o budućim razvojima u planiranju porodice i tretmanu plodnosti, sproveli smo SPACA6 strukturne i biohemijske studije.Kristalna struktura ekstracelularnog domena SPACA6 pokazuje snop sa četiri spirale (4HB) i domen sličan imunoglobulinu (Ig-like) povezane kvazi-fleksibilnim regijama.Kao što je predviđeno u prethodnim studijama,7,32,37 struktura domena SPACA6 je slična onoj kod ljudskog IZUMO1, a dva proteina dijele neobičan motiv: 4HB sa trouglastom spiralnom površinom i par CXXC motiva vezanih za disulfid.Predlažemo da IZUMO1 i SPACA6 sada definiraju veću, strukturno srodnu superfamiliju proteina povezanih sa fuzijom gameta.Koristeći karakteristike jedinstvene za superporodicu, sproveli smo iscrpnu pretragu za AlphaFold strukturnim ljudskim proteomom, identifikujući dodatne članove ove superfamilije, uključujući nekoliko članova uključenih u fuziju i/ili oplodnju gameta.Sada se čini da postoji zajednički strukturni nabor i superfamilija proteina povezanih sa fuzijom gameta, a naša struktura pruža molekularnu mapu ovog važnog aspekta mehanizma fuzije ljudskih gameta.
SPACA6 je jednoprolazni transmembranski protein sa jednim N-vezanim glikanom i šest navodnih disulfidnih veza (Slike S1a i S2).Ekspresirali smo ekstracelularni domen humanog SPACA6 (ostaci 27-246) u Drosophila S2 ćelijama i pročistili protein korišćenjem afiniteta nikla, izmene katjona i hromatografije isključivanja veličine (slika S1b).Prečišćeni SPACA6 ektodomen je vrlo stabilan i homogen.Analiza korištenjem hromatografije isključivanja veličine u kombinaciji sa poligonalnim raspršivanjem svjetlosti (SEC-MALS) otkrila je jedan pik sa izračunatom molekulskom težinom od 26,2 ± 0,5 kDa (slika S1c).Ovo je u skladu sa veličinom SPACA6 monomernog ektodomena, što ukazuje da se oligomerizacija nije dogodila tokom prečišćavanja.Osim toga, spektroskopija kružnog dihroizma (CD) otkrila je mješovitu α/β strukturu s tačkom topljenja od 51,3 °C (slika S1d,e).Dekonvolucija CD spektra otkrila je 38,6% α-helikalnih i 15,8% β-lančanih elemenata (slika S1d).
SPACA6 ektodomen je kristaliziran korištenjem nasumične matrice38 što je rezultiralo skupom podataka s rezolucijom od 2,2 Å (Tabela 1 i Slika S3).Koristeći kombinaciju molekularne supstitucije zasnovane na fragmentima i podataka o fazama SAD sa izlaganjem bromidu za određivanje strukture (Tabela 1 i Slika S4), konačni rafinirani model se sastoji od ostataka 27–246.U vrijeme utvrđivanja strukture nije bilo dostupnih eksperimentalnih ili AlphaFold struktura.SPACA6 ektodomen ima dimenzije 20 Å × 20 Å × 85 Å, sastoji se od sedam spirala i devet β-lanaca, i ima izduženi tercijarni nabor stabiliziran sa šest disulfidnih veza (slika 1a, b).Slaba gustina elektrona na kraju bočnog lanca Asn243 ukazuje da je ovaj ostatak N-vezana glikozilacija.Struktura se sastoji od dva domena: N-terminalnog snopa sa četiri spirale (4HB) i C-terminalnog Ig-sličnog domena sa srednjim zglobnim regionom između njih (slika 1c).
a Struktura ekstracelularnog domena SPACA6.Strip dijagram ekstracelularnog domena SPACA6, boja lanca od N do C-kraja od tamnoplave do tamno crvene.Cisteini uključeni u disulfidne veze su istaknuti magenta.b Topologija ekstracelularnog domena SPACA6.Koristite istu shemu boja kao na slici 1a.c SPACA6 ekstracelularni domen.Dijagrami 4HB, šarke i Ig-like domenske trake obojeni su narandžastom, zelenom i plavom bojom.Slojevi se ne crtaju u mjerilu.
4HB domen SPACA6 uključuje četiri glavne spirale (heliksa 1–4), koje su raspoređene u obliku spiralne spirale (slika 2a), naizmenično između antiparalelnih i paralelnih interakcija (slika 2b).Mala dodatna zavojnica (heliks 1′) položena je okomito na snop, formirajući trokut sa spiralama 1 i 2. Ovaj trokut je blago deformiran u spiralno uvijenom pakiranju relativno gustog pakiranja spirala 3 i 4 ( Slika 2a).
4HB dijagram trake N-terminala.b Pogled odozgo na snop od četiri spirale, od kojih je svaka spirala označena tamnoplavom na N-kraju i tamnocrvenom na C-kraju.c Dijagram spiralnog kotača odozgo prema dolje za 4HB, sa svakim ostatkom prikazanim kao krug označen jednoslovnim kodom aminokiseline;samo su četiri aminokiseline na vrhu kotača numerirane.Nepolarni ostaci su obojeni žutom bojom, polarni nenabijeni ostaci su obojeni zelenom, pozitivno nabijeni ostaci su obojeni plavo, a negativno nabijeni ostaci su obojeni crvenom bojom.d Trokutasta lica domene 4HB, sa 4HB u narandžastoj boji i šarkama u zelenoj boji.Oba umetka pokazuju disulfidne veze u obliku štapa.
4HB je koncentrisan na unutrašnje hidrofobno jezgro koje se sastoji uglavnom od alifatskih i aromatičnih ostataka (slika 2c).Jezgro sadrži disulfidnu vezu između Cys41 i Cys55 koja povezuje spirale 1 i 2 zajedno u gornji podignuti trokut (slika 2d).Dvije dodatne disulfidne veze su formirane između CXXC motiva u Helix 1′ i drugog CXXC motiva pronađenog na vrhu β-ukosnice u području šarke (slika 2d).Konzervativni ostatak arginina s nepoznatom funkcijom (Arg37) nalazi se unutar šupljeg trokuta formiranog od spirala 1′, 1 i 2. Alifatski atomi ugljika Cβ, Cγ i Cδ Arg37 stupaju u interakciju s hidrofobnim jezgrom, a njegove gvanidinske grupe se ciklički kreću između spirala 1′ i 1 putem interakcije između Thr32 kičme i bočnog lanca (slika S5a,b).Tyr34 se proteže u šupljinu ostavljajući dvije male šupljine kroz koje Arg37 može komunicirati sa rastvaračem.
Ig-slični β-sendvič domeni su velika superfamilija proteina koji dijele zajedničku osobinu dva ili više višelančanih amfipatskih β-limova koji međusobno djeluju preko hidrofobnog jezgra 39. C-terminalni Ig-sličan domen SPACA6 ima isti obrazac i sastoji se od dva sloja (slika S6a).List 1 je β-list od četiri lanca (lanci D, F, H i I) gdje lanci F, H i I formiraju antiparalelni raspored, a niti I i D preuzimaju paralelnu interakciju.Tabela 2 je mala antiparalelna dvolančana beta tabla (lanci E i G).Uočena je unutrašnja disulfidna veza između C-kraja E lanca i centra H lanca (Cys170-Cys226) (Sl. S6b).Ova disulfidna veza je analogna disulfidnoj vezi u β-sendvič domenu imunoglobulina40,41.
Četvorolančani β-list se uvija duž cijele dužine, formirajući asimetrične rubove koji se razlikuju po obliku i elektrostatici.Tanja ivica je ravna hidrofobna površina okoline koja se ističe u poređenju sa preostalim neravnim i elektrostatički raznolikim površinama u SPACA6 (slika S6b,c).Halo izloženih karbonil/amino grupa i polarnih bočnih lanaca okružuje hidrofobnu površinu (slika S6c).Šira margina je prekrivena spiralnim segmentom sa kapom koji blokira N-terminalni dio hidrofobnog jezgra i formira tri vodonične veze sa otvorenom polarnom grupom okosnice F lanca (slika S6d).C-terminalni dio ove ivice formira veliki džep sa djelimično izloženim hidrofobnim jezgrom.Džep je okružen pozitivnim nabojem zbog tri seta dvostrukih ostataka arginina (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 i Arg212-Arg214) i centralnog histidina (His220) (slika S6e).
Zglobni region je kratak segment između helikalnog domena i domena sličnog Ig, koji se sastoji od jednog antiparalelnog trolančanog β-sloja (lanci A, B i C), male spirale od 310 i nekoliko dugih nasumičnih spiralnih segmenata.(Sl. S7).Čini se da mreža kovalentnih i elektrostatičkih kontakata u području šarke stabilizira orijentaciju između 4HB i Ig-sličnog domena.Mreža se može podijeliti na tri dijela.Prvi dio uključuje dva CXXC motiva (27CXXC30 i 139CXXC142) koji formiraju par disulfidnih veza između β-ukosnice u šarki i 1′ heliksa u 4HB.Drugi dio uključuje elektrostatičke interakcije između Ig-like domene i šarke.Glu132 u šarki formira slani most sa Arg233 u domenu sličnom Ig i Arg135 u šarki.Treći dio uključuje kovalentnu vezu između Ig-like domene i šarke.Dvije disulfidne veze (Cys124-Cys147 i Cys128-Cys153) povezuju petlju šarke sa linkerom koji je stabiliziran elektrostatičkim interakcijama između Gln131 i funkcionalne grupe kičme, omogućavajući pristup prvom domenu sličnom Ig.lanac.
Struktura ektodomena SPACA6 i pojedinačne strukture 4HB i Ig sličnih domena korištene su za traženje strukturno sličnih zapisa u proteinskim bazama podataka 42 .Identifikovali smo podudaranja sa visokim Dali Z rezultatima, malim standardnim devijacijama i velikim LALI rezultatima (potonji je broj strukturno ekvivalentnih ostataka).Dok je prvih 10 pogodaka iz pune pretrage ektodomene (Tabela S1) imalo prihvatljiv Z-skor od >842, samo pretraga za 4HB ili Ig sličan domen je pokazala da većina ovih pogodaka odgovara samo β-sendvičima.sveprisutni nabor koji se nalazi u mnogim proteinima.Sve tri pretrage u Daliju dale su samo jedan rezultat: IZUMO1.
Dugo se sugeriralo da SPACA6 i IZUMO1 dijele strukturne sličnosti7,32,37.Iako ektodomene ova dva proteina povezana sa fuzijom gameta dijele samo 21% identiteta sekvence (slika S8a), kompleksni dokazi, uključujući očuvani uzorak disulfidne veze i predviđeni C-terminalni Ig-sličan domen u SPACA6, omogućili su rane pokušaje izgradnje homološki model A i SPACA6 miša koristeći IZUMO1 kao šablon37.Naša struktura potvrđuje ova predviđanja i pokazuje pravi stepen sličnosti.U stvari, strukture SPACA6 i IZUMO137,43,44 dijele istu arhitekturu s dva domena (slika S8b) sa sličnim 4HB i Ig-sličnim β-sendvič domenima povezanim zglobnom regijom (slika S8c).
IZUMO1 i SPACA6 4HB imaju zajedničke razlike u odnosu na konvencionalne spiralne snopove.Tipični 4HB, poput onih pronađenih u SNARE proteinskim kompleksima uključenim u endosomalnu fuziju 45,46, imaju ravnomjerno raspoređene spirale koje održavaju konstantnu zakrivljenost oko centralne ose 47. Nasuprot tome, spiralni domeni u IZUMO1 i SPACA6 su bili izobličeni, s promjenjivom zakrivljenošću i neravnomerno pakovanje (slika S8d).Zaokret, vjerovatno uzrokovan trouglom formiranim spiralama 1′, 1 i 2, zadržan je u IZUMO1 i SPACA6 i stabiliziran istim CXXC motivom na spirali 1′.Međutim, dodatna disulfidna veza pronađena u SPACA6 (Cys41 i Cys55 kovalentno povezuju spirale 1 i 2 iznad) stvara oštriji vrh na vrhu trougla, čineći SPACA6 više uvijenim od IZUMO1, sa izraženijim trouglovima šupljine.Osim toga, IZUMO1 nema Arg37 uočen u centru ove šupljine u SPACA6.Nasuprot tome, IZUMO1 ima tipičniju hidrofobnu jezgru od alifatskih i aromatičnih ostataka.
IZUMO1 ima Ig-sličan domen koji se sastoji od dvolančanog i petolančanog β-lista43.Dodatni lanac u IZUMO1 zamjenjuje kalem u SPACA6, koji stupa u interakciju sa F lancem kako bi ograničio vodonične veze kičme u lancu.Zanimljiva tačka poređenja je predviđeni površinski naboj Ig-sličnih domena dva proteina.Površina IZUMO1 je negativnije naelektrisana od površine SPACA6.Dodatni naboj se nalazi u blizini C-kraja okrenutog prema membrani sperme.U SPACA6, iste regije su bile neutralnije ili pozitivno nabijene (slika S8e).Na primjer, hidrofobna površina (tanje ivice) i pozitivno nabijene jame (šire ivice) u SPACA6 su negativno nabijene u IZUMO1.
Iako su veza i elementi sekundarne strukture između IZUMO1 i SPACA6 dobro očuvani, strukturno poravnanje Ig-sličnih domena pokazalo je da se ova dva domena razlikuju po svojoj opštoj orijentaciji jedan u odnosu na drugi (slika S9).Spiralni snop IZUMO1 je zakrivljen oko β-sendviča, stvarajući prethodno opisani oblik „bumeranga“ na oko 50° od centralne ose.Nasuprot tome, spiralni snop u SPACA6 bio je nagnut oko 10° u suprotnom smjeru.Razlike u ovim orijentacijama su vjerovatno zbog razlika u području šarki.Na nivou primarne sekvence, IZUMO1 i SPACA6 imaju malu sličnost sekvenci na šarki, sa izuzetkom cisteina, glicina i ostataka asparaginske kiseline.Kao rezultat toga, vodikove veze i elektrostatičke mreže su potpuno različite.Elemente sekundarne strukture β-listova dijele IZUMO1 i SPACA6, iako su lanci u IZUMO1 mnogo duži, a spirala 310 (heliks 5) je jedinstvena za SPACA6.Ove razlike rezultiraju različitim orijentacijama domena za dva inače slična proteina.
Naša pretraga Dali servera otkrila je da su SPACA6 i IZUMO1 jedine dvije eksperimentalno određene strukture pohranjene u bazi proteina koje imaju ovaj konkretan 4HB preklop (Tabela S1).Nedavno je DeepMind (Alphabet/Google) razvio AlphaFold, sistem zasnovan na neuronskoj mreži koji može precizno predvideti 3D strukture proteina iz primarnih sekvenci48.Ubrzo nakon što smo riješili strukturu SPACA6, objavljena je baza podataka AlphaFold, koja pruža modele prediktivne strukture koji pokrivaju 98,5% svih proteina u ljudskom proteomu48,49.Koristeći našu riješenu SPACA6 strukturu kao model pretraživanja, pretraživanje strukturne homologije za model u AlphaFold ljudskom proteomu identificiralo je kandidate s mogućim strukturnim sličnostima sa SPACA6 i IZUMO1.S obzirom na nevjerovatnu tačnost AlphaFold-a u predviđanju SPACA6 (slika S10a)—posebno ektodomena od 1,1 Årms u poređenju sa našom riješenom strukturom (slika S10b)—možemo biti sigurni da će identificirana SPACA6 podudaranja vjerovatno biti tačna.
Prethodno je PSI-BLAST tražio IZUMO1 klaster sa tri druga proteina povezana sa spermom: IZUMO2, IZUMO3 i IZUMO450.AlphaFold je predvidio da se ovi proteini IZUMO porodice savijaju u 4HB domen sa istim uzorkom disulfidne veze kao IZUMO1 (Slike 3a i S11), iako im nedostaje domen sličan Ig.Pretpostavlja se da su IZUMO2 i IZUMO3 jednostrani membranski proteini slični IZUMO1, dok se IZUMO4 čini da se luči.Funkcije IZUMO 2, 3 i 4 proteina u fuziji gameta nisu određene.Poznato je da IZUMO3 igra ulogu u biogenezi akrozoma tokom razvoja spermatozoida51, a utvrđeno je da IZUMO protein formira kompleks50.Konzervacija IZUMO proteina kod sisara, gmizavaca i vodozemaca sugerira da je njihova potencijalna funkcija u skladu s onom drugih poznatih proteina povezanih s fuzijom gameta, kao što su DCST1/2, SOF1 i FIMP.
Dijagram arhitekture domena IST superfamilije, sa 4HB, šarkama i domenima sličnim Ig istaknutim narandžastom, zelenom i plavom bojom.IZUMO4 ima jedinstvenu C-terminalnu regiju koja izgleda crno.Potvrđene i pretpostavljene disulfidne veze prikazane su punim i isprekidanim linijama.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F95), i DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) prikazani su u istom rasponu boja kao i panel A. Disulfidne veze su prikazane magenta.TMEM95, IZUMO2 i IZUMO3 transmembranske spirale nisu prikazane.
Za razliku od IZUMO proteina, smatra se da su drugi SPACA proteini (tj. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 i SPACA9) strukturno različiti od SPACA6 (slika S12).Samo SPACA9 ima 4HB, ali se ne očekuje da ima istu paralelno-antiparalelnu orijentaciju ili istu disulfidnu vezu kao SPACA6.Samo SPACA1 ima sličnu Ig domenu.AlphaFold predviđa da SPACA3, SPACA4 i SPACA5 imaju potpuno drugačiju strukturu od SPACA6.Zanimljivo je da je poznato da SPACA4 takođe igra ulogu u oplodnji, ali u većoj meri od SPACA6, umesto toga olakšava interakciju između sperme i jajne ćelije zona pellucida52.
Naša AlphaFold pretraga pronašla je još jednu utakmicu za IZUMO1 i SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, jedan transmembranski protein specifičan za spermu, čini mužjake miševa neplodnim kada se ablatira 32,33.Spermatozoidi kojima nedostaje TMEM95 imali su normalnu morfologiju, pokretljivost i sposobnost da prodru u zonu pellucida i vežu se za membranu jajeta, ali se nisu mogli spojiti sa membranom oocita.Prethodne studije su pokazale da TMEM95 deli strukturne sličnosti sa IZUMO133.Zaista, AlphaFold model je potvrdio da je TMEM95 4HB sa istim parom CXXC motiva kao IZUMO1 i SPACA6 i istom dodatnom disulfidnom vezom između spirala 1 i 2 koja se nalazi u SPACA6 (sl. 3a i S11).Iako TMEM95 nema domen sličan Ig-u, on ima region sa uzorkom disulfidne veze sličan SPACA6 i IZUMO1 regionima šarke (slika 3b).U vrijeme objavljivanja ovog rukopisa, server za preprint prijavio je strukturu TMEM95, potvrđujući rezultat AlphaFold53.TMEM95 je vrlo sličan SPACA6 i IZUMO1 i evolucijski je konzerviran već kod vodozemaca (sl. 4 i S13).
PSI-BLAST pretraga je koristila baze podataka NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP i SOF1 da bi se odredila pozicija ovih sekvenci na stablu života.Udaljenosti između tačaka grananja nisu prikazane u mjerilu.
Upečatljiva ukupna strukturna sličnost između SPACA6 i IZUMO1 sugerira da su oni osnivači očuvane strukturne superfamilije koja uključuje proteine ​​TMEM95 i IZUMO 2, 3 i 4.poznati članovi: IZUMO1, SPACA6 i TMEM95.Budući da samo nekoliko članova posjeduje domene slične Ig, zaštitni znak IST superfamilije je 4HB domen, koji ima jedinstvene karakteristike zajedničke svim ovim proteinima: 1) Namotani 4HB sa spiralama raspoređenim u antiparalelnoj/paralelnoj alternaciji (sl. . 5a), 2) snop ima trouglasto lice koje se sastoji od dvije spirale unutar snopa i treće vertikalne spirale (sl. ključno područje (slika 5c). Poznato je da CXXC motiv, koji se nalazi u proteinima sličnim tioredoksinu, funkcionira kao redoks senzor 54,55,56, dok se motiv kod članova porodice IST može povezati sa protein disulfid izomerazama kao što je ERp57 u fuziji gameta.Uloge su povezane 57,58.
Članovi IST superfamilije su definisani sa tri karakteristične karakteristike 4HB domena: četiri spirale koje se naizmjenično nalaze između paralelne i antiparalelne orijentacije, ba-trokutaste spiralne površine snopa i ca CXXC dvostruki motiv formiran između malih molekula.) N-terminalne spirale (narandžasta) i β-ukosnica (zelena).
S obzirom na sličnost između SPACA6 i IZUMO1, testirana je sposobnost prvog da se veže za IZUMO1 ili JUNO.Interferometrija biosloja (BLI) je kinetički zasnovana metoda vezivanja koja je ranije korištena za kvantifikaciju interakcije između IZUMO1 i JUNO.Nakon inkubacije senzora označenog biotinom sa IZUMO1 kao mamcem sa visokom koncentracijom JUNO analita, detektovan je jak signal (slika S14a), što ukazuje na promjenu debljine biomaterijala pričvršćenog za vrh senzora uzrokovanu vezivanjem.Slični signali (tj. JUNO spojen sa senzorom kao mamac protiv IZUMO1 analita) (slika S14b).Nije detektovan signal kada je SPACA6 korišten kao analit protiv IZUMO1 ili JUNO vezanog za senzor (Slika S14a,b).Odsustvo ovog signala ukazuje da ekstracelularni domen SPACA6 ne stupa u interakciju sa ekstracelularnim domenom IZUMO1 ili JUNO.
Budući da se BLI test temelji na biotinilaciji slobodnih lizinskih ostataka na proteinu mamaca, ova modifikacija može spriječiti vezivanje ako su ostaci lizina uključeni u interakciju.Osim toga, orijentacija vezivanja u odnosu na senzor može stvoriti sterične smetnje, tako da su konvencionalni testovi povlačenja također izvedeni na rekombinantnim SPACA6, IZUMO1 i JUNO ektodomenima.Uprkos tome, SPACA6 nije precipitirao sa His-označenim IZUMO1 ili His-označenim JUNO (Slika S14c,d), što ukazuje da nema interakcije u skladu sa onom uočenom u BLI eksperimentima.Kao pozitivnu kontrolu, potvrdili smo interakciju JUNO-a sa označenim His IZUMO1 (slike S14e i S15).
Uprkos strukturnoj sličnosti između SPACA6 i IZUMO1, nemogućnost SPACA6 da veže JUNO nije iznenađujuća.Površina ljudskog IZUMO1 ima više od 20 ostataka koji stupaju u interakciju sa JUNO, uključujući ostatke iz svake od tri regije (iako se većina njih nalazi u području šarke) (slika S14f).Od ovih ostataka, samo jedan je konzerviran u SPACA6 (Glu70).Dok su mnoge zamjene ostataka zadržale svoja originalna biohemijska svojstva, esencijalni Arg160 ostatak u IZUMO1 zamijenjen je negativno nabijenim Asp148 u SPACA6;prethodne studije su pokazale da mutacija Arg160Glu u IZUMO1 gotovo potpuno ukida vezivanje za JUNO43.Osim toga, razlika u orijentaciji domena između IZUMO1 i SPACA6 značajno je povećala površinu JUNO-vezujućeg mjesta ekvivalentne regije na SPACA6 (slika S14g).
Uprkos poznatoj potrebi za SPACA6 za fuziju gameta i njegovoj sličnosti sa IZUMO1, čini se da SPACA6 nema ekvivalentnu funkciju vezivanja JUNO.Stoga smo nastojali kombinirati naše strukturne podatke sa dokazima važnosti koje nam pruža evolucijska biologija.Poravnavanje sekvenci homologa SPACA6 pokazuje očuvanje zajedničke strukture izvan sisara.Na primjer, ostaci cisteina prisutni su čak i kod daleko srodnih vodozemaca (slika 6a).Koristeći ConSurf server, podaci o zadržavanju višestrukih sekvenci od 66 sekvenci su mapirani na površinu SPACA6.Ova vrsta analize može pokazati koji su ostaci sačuvani tokom evolucije proteina i može ukazati koji površinski regioni igraju ulogu u funkciji.
a Poravnavanje sekvenci SPACA6 ektodomena iz 12 različitih vrsta pripremljenih pomoću CLUSTAL OMEGA.Prema ConSurf analizi, najkonzervativnije pozicije su označene plavom bojom.Cisteinski ostaci su označeni crvenom bojom.Granice domena i elementi sekundarne strukture prikazani su na vrhu poravnanja, gdje strelice označavaju β-nivice, a valovi spirale.NCBI pristupni identifikatori koji sadrže sekvence su: čovjek (Homo sapiens, NP_001303901), mandrila (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapucin majmun (Cebus mimic, XP_017359366), konj (Equ06, Equ06) s orca3_23 XP_032_034) .), ovca (Ovis aries, XP_014955560), slon (Loxodonta africana, XP_010585293), pas (Canis lupus familyis, XP_025277208), miš (Mus musculus, NP_001156381, XPsman36381, XPris056381, Tashar XPris06381), _0318), Platypus, 8) , 61_89 i Žaba bik (Bufo bufo, XP_040282113).Numeracija je zasnovana na ljudskom poretku.b Površinski prikaz strukture SPACA6 sa 4HB na vrhu i Ig-like domenom na dnu, boje zasnovane na procjenama očuvanja sa ConSurf servera.Najbolje očuvani dijelovi su u plavoj boji, umjereno očuvani u bijeloj, a najmanje očuvani u žutoj boji.ljubičasti cistein.Tri površinske zakrpe koje demonstriraju visok nivo zaštite prikazane su na umetcima označenim zakrpe 1, 2 i 3. 4HB crtani film je prikazan na umetku u gornjem desnom uglu (ista šema boja).
Struktura SPACA6 ima tri visoko očuvana područja površine (slika 6b).Zakrpa 1 obuhvata 4HB i zglobnu regiju i sadrži dva konzervirana CXXC disulfidna mosta, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 mrežu šarki (slika S7) i tri konzervirana vanjska aromatična ostatka (Phe31, Tyr73, Phe137).širi rub Ig-like domene (slika S6e), koji predstavlja nekoliko pozitivno nabijenih ostataka na površini sperme.Zanimljivo je da ovaj flaster sadrži epitop antitijela za koji je ranije pokazano da ometa funkciju SPACA6 30.Region 3 obuhvata šarku i jednu stranu Ig-like domene;ova regija sadrži konzervirane proline (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) i polarne/nabijene ostatke okrenute prema van.Iznenađujuće, većina ostataka na površini 4HB je vrlo varijabilna (slika 6b), iako je nabor očuvan kroz homolog SPACA6 (što ukazuje konzervativizam jezgre hidrofobnog snopa) i izvan IST superfamilije.
Iako je ovo najmanja regija u SPACA6 s najmanje detektabilnih elemenata sekundarne strukture, mnogi ostaci šarke (uključujući regiju 3) su visoko konzervirani među SPACA6 homolozima, što može ukazivati ​​na to da orijentacija spiralnog snopa i β-sendviča igra ulogu.kao konzervativac.Međutim, uprkos ekstenzivnim vodoničnim vezama i elektrostatičkim mrežama u području šarki SPACA6 i IZUMO1, dokaz intrinzične fleksibilnosti može se vidjeti u poravnanju višestrukih dozvoljenih struktura IZUMO137,43,44.Poravnanje pojedinačnih domena se dobro preklapalo, ali je orijentacija domena jedna u odnosu na drugu varirala od 50° do 70° u odnosu na centralnu ose (slika S16).Da bi se razumjela konformacijska dinamika SPACA6 u otopini, izvedeni su SAXS eksperimenti (slika S17a,b).Ab initio rekonstrukcija SPACA6 ektodomena bila je u skladu sa kristalnom strukturom štapa (Sl. S18), iako je Kratkyjev dijagram pokazao određeni stepen fleksibilnosti (Slika S17b).Ova konformacija je u suprotnosti sa IZUMO1, u kojoj nevezani protein poprima oblik bumeranga iu rešetki iu rastvoru43.
Da bi se specifično identifikovao fleksibilni region, sprovedena je masena spektroskopija izmene vodonik-deuterijum (H-DXMS) na SPACA6 i upoređena sa podacima prethodno dobijenim na IZUMO143 (slika 7a,b).SPACA6 je očigledno fleksibilniji od IZUMO1, što dokazuje veća izmjena deuterijuma u cijeloj strukturi nakon 100.000 s izmjene.U obe strukture, C-terminalni deo zglobnog regiona pokazuje visok nivo razmene, što verovatno dozvoljava ograničenu rotaciju 4HB i Ig sličnih domena u odnosu jedan na drugi.Zanimljivo je da je C-terminalni dio šarke SPACA6, koji se sastoji od ostatka 147CDLPLDCP154, visoko konzervirana regija 3 (Slika 6b), što možda ukazuje da je fleksibilnost međudomena evolucijski očuvana karakteristika SPACA6.Prema analizi fleksibilnosti, CD termalni podaci o topljenju pokazali su da je SPACA6 (Tm = 51,2°C) manje stabilan od IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (sl. S1e i S19).
a H-DXMS slike SPACA6 i b IZUMO1.Procenat razmene deuterija određen je u naznačenim vremenskim tačkama.Nivoi razmjene vodonik-deuterijum su označeni bojom na skali gradijenta od plave (10%) do crvene (90%).Crne kutije predstavljaju područja visoke razmjene.Granice 4HB, šarke i Ig-like domene uočene u kristalnoj strukturi prikazane su iznad primarne sekvence.Nivoi razmjene deuterijuma na 10 s, 1000 s i 100 000 s ucrtani su na trakastom grafikonu koji je postavljen na transparentne molekularne površine SPACA6 i IZUMO1.Dijelovi struktura sa razmjenom deuterija ispod 50% obojeni su bijelom bojom.Područja iznad 50% H-DXMS razmjene su obojena u skali gradijenta.
Upotreba CRISPR/Cas9 i genetske strategije za nokautiranje mišjih gena dovela je do identifikacije nekoliko faktora važnih za vezivanje i fuziju sperme i jajne ćelije.Osim dobro karakterizirane interakcije IZUMO1-JUNO i CD9 strukture, većina proteina povezanih sa fuzijom gameta ostaje strukturno i funkcionalno zagonetna.Biofizička i strukturna karakterizacija SPACA6 je još jedan dio molekularne slagalice adhezije/fuzije tokom oplodnje.
Čini se da su SPACA6 i drugi članovi superfamilije IST visoko očuvani kod sisara, kao i kod pojedinačnih ptica, gmizavaca i vodozemaca;u stvari, smatra se da je SPACA6 čak potreban za oplodnju u zebrice 59. Ova distribucija je slična drugim poznatim proteinima povezanim sa fuzijom gameta kao što su DCST134, DCST234, FIMP31 i SOF132, što sugerira da su ovi faktori deficijentni za HAP2 (također poznati kao GCS1) proteini koji su odgovorni za katalitičku aktivnost mnogih protista., biljke i člankonošci.Oplođeni fuzioni proteini 60, 61. Uprkos snažnoj strukturnoj sličnosti između SPACA6 i IZUMO1, nokautiranje gena koji kodiraju bilo koji od ovih proteina rezultiralo je neplodnošću kod mužjaka miševa, što ukazuje da njihove funkcije u fuziji gameta nisu duplicirane..U širem smislu, nijedan od poznatih proteina sperme potrebnih za fazu adhezije fuzije nije suvišan.
Ostaje otvoreno pitanje da li SPACA6 (i drugi članovi IST superfamilije) učestvuju u intergametskim spojevima, formiraju intragametske mreže za regrutovanje važnih proteina do fuzijskih tačaka, ili možda čak deluju kao neuhvatljivi fuzogeni.Studije ko-imunoprecipitacije u ćelijama HEK293T otkrile su interakciju između IZUMO1 pune dužine i SPACA632.Međutim, naši rekombinantni ektodomeni nisu interagovali in vitro, što sugeriše da su interakcije viđene u Noda et al.oba su izbrisana u konstruktu (obratite pažnju na citoplazmatski rep IZUMO1, za koji se pokazalo da nije neophodan za oplodnju62).Alternativno, IZUMO1 i/ili SPACA6 mogu zahtijevati specifično vezivno okruženje koje ne reprodukujemo in vitro, kao što su fiziološki specifične konformacije ili molekularni kompleksi koji sadrže druge proteine ​​(poznate ili još uvijek neotkrivene).Iako se vjeruje da IZUMO1 ektodomena posreduje vezivanje spermatozoida za jajnu stanicu u perivitelinskom prostoru, svrha ektodomena SPACA6 je nejasna.
Struktura SPACA6 otkriva nekoliko očuvanih površina koje mogu biti uključene u interakcije proteina i proteina.Očuvani dio šarke neposredno uz motiv CXXC (označen kao Zakrpa 1 iznad) ima nekoliko aromatičnih ostataka okrenutih prema van koji su često povezani sa hidrofobnim i π-slaganim interakcijama između biomolekula.Široke strane Ig-sličnog domena (regija 2) formiraju pozitivno nabijenu brazdu sa visoko konzerviranim Arg i His ostacima, a antitela protiv ovog regiona su prethodno korišćena da blokiraju fuziju gameta 30 .Antitijelo prepoznaje linearni epitop 212RIRPAQLTHRGTFS225, koji ima tri od šest argininskih ostataka i visoko konzervirani His220.Nije jasno da li je disfunkcija posljedica blokade ovih specifičnih ostataka ili cijele regije.Lokacija ovog jaza u blizini C-terminusa β-sendviča ukazuje na cis interakcije sa susjednim proteinima sperme, ali ne i sa proteinima oocita.Nadalje, zadržavanje visoko fleksibilnog spleta bogatog prolinom (mjesto 3) unutar šarke može biti mjesto interakcije protein-protein ili, što je vjerojatnije, ukazati na zadržavanje fleksibilnosti između dva domena.Rod je važan za nepoznatu ulogu SPACA6.fuziju gameta.
SPACA6 ima svojstva proteina međustanične adhezije, uključujući Ig-slike β-sendviče.Mnogi adhezivni proteini (npr. kadherini, integrini, adhezini i IZUMO1) posjeduju jedan ili više β-sendvič domena koji protežu proteine ​​od ćelijske membrane do njihovih ekoloških ciljeva63,64,65.Ig-sličan domen SPACA6 takođe sadrži motiv koji se obično nalazi u β-sendvičima adhezije i kohezije: dubleti paralelnih niti na krajevima β-sendviča, poznati kao mehaničke stezaljke66.Vjeruje se da ovaj motiv povećava otpornost na smične sile, što je dragocjeno za proteine ​​uključene u međućelijske interakcije.Međutim, uprkos ovoj sličnosti sa adhezinima, trenutno nema dokaza da SPACA6 interaguje sa bjelanjcima.SPACA6 ektodomen nije u stanju da se veže za JUNO, a ćelije HEK293T koje eksprimiraju SPACA6, kao što je ovdje prikazano, teško stupaju u interakciju sa oocitima kojima nedostaje zona 32.Ako SPACA6 uspostavi intergametske veze, ove interakcije mogu zahtijevati posttranslacijske modifikacije ili biti stabilizirane drugim proteinima sperme.U prilog potonjoj hipotezi, spermatozoidi sa nedostatkom IZUMO1 vezuju se za oocite, pokazujući da su molekuli različiti od IZUMO1 uključeni u korak adhezije gameta 27 .
Mnogi virusni, stanični i razvojni fuzioni proteini imaju svojstva koja predviđaju njihovu funkciju fuzogena.Na primjer, virusni fuzioni glikoproteini (klase I, II i III) imaju hidrofobni fuzioni peptid ili petlju na kraju proteina koji je umetnut u membranu domaćina.Mapa hidrofilnosti IZUMO143 i struktura (utvrđena i predviđena) IST superfamilije nisu pokazala očigledan hidrofobni fuzioni peptid.Dakle, ako bilo koji protein u IST superfamiliji funkcionira kao fuzogen, oni to rade na način drugačiji od drugih poznatih primjera.
U zaključku, funkcije članova IST superfamilije proteina povezanih sa fuzijom gameta ostaju primamljiva misterija.Naš karakterizirani rekombinantni molekul SPACA6 i njegova razriješena struktura pružit će uvid u odnose između ovih zajedničkih struktura i njihove uloge u vezivanju i fuziji gameta.
DNK sekvenca koja odgovara predviđenom humanom SPACA6 ektodomenu (NCBI pristupni broj NP_001303901.1; ostaci 27–246) je optimizirana kodonom za ekspresiju u ćelijama Drosophila melanogaster S2 i sintetizirana kao fragment gena sa sekvencom koja kodira Kozak Genom (Eurofin)., signal sekrecije BiP i odgovarajući 5′ i 3′ krajevi za kloniranje ovog gena nezavisno od ligacije u pMT ekspresijski vektor baziran na promotoru metalotioneina modifikovanog za selekciju puromicinom (pMT-puro).pMT-puro vektor kodira mjesto cijepanja trombina nakon čega slijedi 10x-His C-terminalna oznaka (slika S2).
Stabilna transfekcija SPACA6 pMT-puro vektora u ćelije D. melanogaster S2 (Gibco) izvedena je slično protokolu koji se koristi za IZUMO1 i JUNO43.S2 ćelije su odmrznute i uzgajane u Schneiderovom mediju (Gibco) dopunjenom konačnom koncentracijom od 10% (v/v) toplinom inaktiviranog fetalnog telećeg seruma (Gibco) i 1X antimikotičkog antibiotika (Gibco).Ćelije ranog prolaza (3,0 x 106 ćelija) su postavljene u pojedinačne jažice ploča sa 6 jažica (Corning).Nakon 24 sata inkubacije na 27°C, ćelije su transficirane mješavinom od 2 mg SPACA6 pMT-puro vektora i Effectene transfekcionog reagensa (Qiagen) prema protokolu proizvođača.Transficirane ćelije su inkubirane 72 sata, a zatim sakupljene sa 6 mg/ml puromicina.Ćelije su zatim izolovane iz kompletnog Schneider-ovog medijuma i stavljene u Insect-XPRESS medijum bez seruma (Lonza) za proizvodnju proteina velikih razmera.Šarža S2 ćelijske kulture od 1 L uzgajana je do 8-10 × 106 ml-1 ćelija u 2 L ventiliranoj polipropilenskoj Erlenmajer tikvici s ravnim dnom, a zatim sterilizirana konačnom koncentracijom od 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) i sterilno filtrirana.inducirano.Inducirane kulture su inkubirane na 27°C na 120 rpm tokom četiri dana.
Kondicionirani medijum koji sadrži SPACA6 izolovan je centrifugiranjem na 5660×g na 4°C, a zatim sistemom filtracije Centramate tangencijalnog protoka (Pall Corp) sa 10 kDa MWCO membranom.Nanesite koncentrovani medijum koji sadrži SPACA6 na kolonu od 2 ml Ni-NTA agarozne smole (Qiagen).Ni-NTA smola je isprana sa 10 kolonskih zapremina (CV) pufera A, a zatim je dodan 1 CV pufera A da bi se dobila konačna koncentracija imidazola od 50 mM.SPACA6 je eluiran sa 10 ml pufera A sa dodatkom imidazola do konačne koncentracije od 500 mM.Trombin restrikcione klase (Millipore Sigma) je dodan direktno u cijev za dijalizu (MWCO 12-14 kDa) u 1 jedinici po mg SPACA6 u odnosu na 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 i 150 mM NaCl (pufer B) za dijalizu.) na 4°C tokom 48 sati.SPACA6 razdvojen trombinom je zatim razrijeđen trostruko da bi se smanjila koncentracija soli i stavljen na 1 ml MonoS 5/50 GL kolonu katjonske izmjene (Cytiva/GE) ekvilibriranu sa 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Kationski izmjenjivač je ispran sa 3 CV 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, zatim je SPACA6 eluiran linearnim gradijentom od 0 do 500 mM NaCl u 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 za 25 CV.Nakon jonoizmenjivačke hromatografije, SPACA6 je koncentrisan na 1 ml i eluiran izokratski sa ENrich SEC650 10 x 300 kolone (BioRad) ekvilibrisane puferom B. Prema hromatogramu, frakcije sakupljene i koncentrovane koje sadrže SPACA6.Čistoća je kontrolirana Coomassie obojenom elektroforezom na 16% SDS-poliakrilamidnom gelu.Koncentracija proteina je kvantificirana apsorbancijom na 280 nm koristeći Beer-Lambertov zakon i teorijski koeficijent molarne ekstinkcije.
Prečišćeni SPACA6 je dijaliziran preko noći protiv 10 mM natrijum fosfata, pH 7,4 i 150 mM NaF i razrijeđen do 0,16 mg/mL prije analize CD spektroskopijom.Spektralno skeniranje CD-ova talasne dužine od 185 do 260 nm prikupljeno je na spektropolarimetru Jasco J-1500 korišćenjem kvarcnih kiveta sa dužinom optičkog puta od 1 mm (Helma) na 25°C brzinom od 50 nm/min.Spektri CD-a su korigovani na bazi, usrednjeni za 10 akvizicija i pretvoreni u srednju rezidualnu eliptičnost (θMRE) u stepenima cm2/dmol:
gdje je MW molekulska težina svakog uzorka u Da;N je broj aminokiselina;θ je eliptičnost u milistepenima;d odgovara dužini optičke putanje u cm;koncentracija proteina u jedinicama.